Lipozomal Kompleksler Kullanılarak Prion Protein Susturması için Nöronlara Hedeflenen siRNA Dağıtımı

Özet

Kaynak: Bender, H. R., et.al. Terapötik siRNA'nın katyonik ve anyonik lipozomlar kullanılarak CNS'ye verilmesi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, prion proteini (PrP) siRNA'nın lipozomal siRNA-peptit kompleksleri (LSPC'ler) kullanılarak nöronlara hedefli dağıtımını göstermektedir. Katyonik lipozomlar, kan-beyin bariyeri boyunca reseptör aracılı taşıma için RVG-9r peptidi tarafından daha da stabilize edilen PrP hedefleme siRNA'yı elektrostatik olarak bağlar. Beynin içine girdikten sonra, LSPC'ler nöronlarda endositoza uğrar, RNA girişimini başlatmak için siRNA'yı serbest bırakır, PrP ekspresyonunu azaltır ve prion hastalığının ilerlemesini kesintiye uğratır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. LSPC'lerin Hazırlanması LSPC'ler

1. için 1: 1 DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonyum-propan) kullanın: kolesterol oranı. 4 nmol lipozom hazırlığı için, 2 nmol DOTAP ve 2 nmol kolesterolü bir şişede 10 ml 1: 1 kloroform: metanol çözeltisine karıştırın.
2. Bir davlumbazda N₂ gazı kullanarak 9 ml kloroform: metanol çözeltisini buharlaştırın. Son 1 ml çözücüyü bir çeker ocakta gece boyunca gazsız olarak buharlaştırın. Şişenin dibinde ince bir lipit filmi gözlemleyin.
3. 10 ml% 10'luk bir sükroz çözeltisini 55 ° C'ye ısıtın.
4. Isıtılmış% 10'luk sükroz çözeltisini ince lipit filmin üzerine yavaşça, yani 1 ml / dak dökün ve şişeyi hafifçe döndürün. %10 sükrozu ve lipitlerle şişeyi 55 °C'de tutun, böylece lipit molekülleri jel-sıvı fazda kalır. Rehidrasyon, çok katmanlı vezikül (MLV) oluşumuna neden olur.
5. Lipozomları boyutlandırmadan önce lipitlerin en az bir saat boyunca 55 ° C'de rehidre olmasına izin verin.
6. Üreticinin talimatlarına göre 1.0 μm filtrelerle bir ekstrüder monte edin veya boyutlandırma için 1.0 μm şırınga filtreleri kullanın.
7. Ekstrüder üzerindeki şırıngalardan birine 1 ml ısıtılmış lipozom süspansiyonu ekleyin ve süspansiyonu iki şırınga arasında 11 kez geçirin. 11 geçişten sonra süspansiyonun başlangıç şırıngasından zıt şırıngada olduğundan emin olun.
8. Lipozomları tekrar 0.45 μm, ardından 0.2 μm filtrelerle boyutlandırın, böylece büyük unilamellar veziküller (LUV'ler) oluşturun. Daha kolay boyutlandırma için lipozom süspansiyonunu sıcak tutun.
9. 4 nmol lipozom süspansiyonunun (200 μM) 20 μl'sini 200 μl'lik 20 μM (toplam 4 nmol) stok siRNA çözeltisi ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
10. 500 μM (toplam 40 nmole) stok RVG-9r çözeltisinin 80 μl'sini siRNA/lipozom çözeltisi ile RT'de 10 dakika inkübe edin. LSPC'ler mümkün olan en kısa sürede kullanılmalıdır, ancak hazırlandıktan sonra birkaç saate kadar kullanılabilir. LSPC'leri hazırlandıktan sonra birkaç saat boyunca 4 °C'de saklayın.

2. Farelere LSPC'ler Enjekte Etme:

1. Damar sistemini genişletmek için fareleri 5-10 dakika boyunca bir ısı lambasına maruz bırakın.
2. Enjeksiyondan 5-10 dakika önce ve enjeksiyon sırasında fareyi %2-3 izofloran/oksijen akışı ile uyuşturun. Hayvan artık ayakta olmadığında ve solunumlar yavaşladığında, bir ayak parmağını çimdikleyerek anesteziyi onaylayın. Kuyruk damarına erişmek için fareyi arkasına veya yanına yerleştirin. Anestezi altındayken kurumayı önlemek için farenin gözlerine veteriner merhemi kullanın.
3. Kuyruğu %70 EtOH ile silin/püskürtün ve 26 G'lik bir insülin şırıngası kullanarak farenin kuyruk damarına 300 μl LSPC enjekte edin. Kuyruk damarına distal olarak enjekte etmeye başlayın ve damar çökerse veya yırtılırsa proksimal olarak hareket edin.
4. Fareyi sternal yaslanma özelliğini koruyana kadar temiz bir kafese koyun. Tamamen iyileşene kadar fareyi diğer kafes arkadaşlarıyla birlikte koymayın. Fareler 5 ila 15 dakika içinde iyileşmelidir. İyileşme daha uzun sürerse vücut ısısını korumak için bir ısıtma yastığına veya bir ısı lambasının altına yerleştirilebilirler. Aşırı ısınmaya karşı koruma sağlamak için fareler yakından izlenmelidir.
5. Anestezinin etkisini yitirdiğinden ve tedavinin herhangi bir kötü etkisi olmadığından emin olmak için enjeksiyondan birkaç saat sonra hayvanı izleyin. LSPC'lerin en az 24 saat dolaşmasına izin verin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DOTAP lipid	Avanti Lipids	890890
Kolesterol	Avanti Lipidleri	700000
Kloroform	Fisher Scientific	AC268320010
Metanol	EMD Millipore 113351
N₂ Gazlı	AirGas
Sükroz	Fisher Scientific	S5-500
Ekstruder	Avanti Lipids	610023
1.0, 0.4 ve 0.2 μm filtreler	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006