$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Ki67 Hücre Proliferasyon Testi
- Ki67 Hücre Proliferasyon Testi (İmmünositokimya)
- Hücre kültürlerini 0.1 M fosfat (PO4) tamponu ile bir dakika iki kez durulayın. Kültürü oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin. PFA'yı çıkarın ve kuyuları PBS ile üç kez yedi dakika durulayın.
- Son durulamadan sonra, her bir oyuğa 100 μl bloker solüsyonu (fosfat tampon salin,% 5 normal eşek serumu,% 0.4 sığır albümin serumu ve% 0.2 Triton X-100) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Birincil antikoru olan tavşan anti-Ki67'yi, 1:200'lük bir çalışma oranında bloker solüsyonu içinde seyrelterek hazırlayın.
- Bloker solüsyonu çıkarın ve her bir oyuğa 100 μl primer antikor solüsyonu uygulayın. 96 oyuklu plakayı örtün ve numuneleri gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, antikor solüsyonunu çıkarın ve 3 kez 7 dakika boyunca PBS ile durulayın.
- İkincil antikoru, eşek anti-tavşan Cy3'ü 1:500'lük bir çalışma oranında bloke edici çözelti içinde hazırlayın. İkincil antikor çözeltisine 1:100 oranında DAPI nükleer lekesi ekleyin. Son PBS durulamasının çıkarılmasından sonra, her oyuğa 100 μl ikincil antikor / DAPI çözeltisi uygulayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin.
- İkincil antikoru / DAPI çözeltisini çıkarın ve her bir kuyuyu PBS ile 7 dakika, 3 kez durulayın. 96 oyuklu plakayı örtün ve görüntüleme yapılana kadar 4 °C'de saklayın.
2. Otomatik Görüntüleme ve Çok Dalga Boyu Puanlama Analizi
:
- HCS sistemine 96 oyuklu bir plaka (daha önce Ki67 immünoetiketleme için işlenmiş) yükleyin ve plakanın 20 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. HCS sistemi görüntü alma ve analiz yazılımını açın.
- 1'de kamera gruplamasını ve 2'de kazanç ayarını kullanarak 10X hedefi için alım ayarlarını seçin. Otomatik Pozlama işlevini kullanarak hücrelerin bulunduğu Z düzlemini bulun ve ilgilenilen her dalga boyu için ofseti hesaplayın. Bu analiz için DAPI (W1), Cy3 (W2) için görüntüler yakalayın. Negatif kontrol kuyularının görüntü alımı için sinyal göstermediği maksimum yoğunluk seviyesini seçin. Bu ayarın pozitif kuyular için uygun olduğunu onaylayın.
- Plaka al. Görüntüleri yakalayın ve bunları görüntü elde etme ve analiz yazılımının veritabanında saklayın.
- Görüntüler elde edildikten sonra, görüntü alma ve analiz çevrimdışı yazılımını açın ve yukarıda elde edilen görüntülerden plaka verilerini gözden geçirin.
- Çok dalga boyu puanlama analizini seçin. Her dalga boyu için minimum ve maksimum yoğunlukları yapılandırın.
NOT: DAPI algılaması, her görünür çekirdeğin etrafındaki lekelenmeyi işaretlemelidir. Cy3, Ki67 immünoreaktivitesi (IR) olan pozitif hücreleri tespit etmeli ve negatif kontroller altında IR'yi tespit etmemelidir. Cy3 Ki67 IR için yaklaşık minimum genişlik 7 μm, yaklaşık maksimum genişlik 30 μm, yerel arka planın üzerindeki yoğunluk 150 gri seviye ve minimum lekeli alan 50μm2 idi. - Tüm pozisyonlar için analiz yapın. Verileri elektronik tabloda görüntülemek için dışa aktarın.