Nöroterapötik Uygulamalar için Genetik Olarak Tasarlanmış Mezenkimal Kök Hücrelerin Karakterizasyonu

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Sharma, A. D., et.al. Nöroprotektif stratejiler için terapötik faktörlerin sağlanması için tasarlanmış yetişkin kök hücrelerin yüksek verimli karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, terapötik nörotrofik faktörleri eksprese etmek için tasarlanmış transgenik mezenkimal kök hücreleri karakterize etme sürecini göstermektedir. Bir hücre proliferasyon markörünü hedefleyen birincil ve ikincil antikorlarla hücrelerin sabitlenmesi, geçirgenleştirilmesi ve boyanması ile ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir, ardından çekirdeklerdeki floresan sinyalleri yakalamak için yüksek içerikli bir tarama sistemi kullanılarak analiz yapılır. Artmış proliferasyon belirteç ekspresyonu, transgenik hücrelerin nöroterapötik uygulamalar için uygunluğunu doğrular.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Ki67 Hücre Proliferasyon Testi

Ki67 Hücre Proliferasyon Testi (İmmünositokimya)
1. Hücre kültürlerini 0.1 M fosfat (PO₄) tamponu ile bir dakika iki kez durulayın. Kültürü oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin. PFA'yı çıkarın ve kuyuları PBS ile üç kez yedi dakika durulayın.
2. Son durulamadan sonra, her bir oyuğa 100 μl bloker solüsyonu (fosfat tampon salin,% 5 normal eşek serumu,% 0.4 sığır albümin serumu ve% 0.2 Triton X-100) ekleyin ve o....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
96 kuyulu plakalar	Greiner Bio One	655090	ImageXpress'te kullanılmak üzere seçilen 96 oyuklu plaka
Sığır serum albümini (BSA)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	A9647
Tavşan anti-Ki67	antikoru Abcam ( Cambridge, MA)	Ab16667	1:200 seyreltme
DAPI	Invitrogen (Carlsbad, CA)	D3571
Eşek anti-Tavşan Cy3	Jackson İmmünoRes Laboratuvarı (West Grove, PA)	711-165-152	1:500 seyreltme
Yetişkin C57BL/6 farelerin Fare MSC'leri	Gen Terapisi için Tulane Cent (New Orleans, LA)		Kemik iliğinden izole edilmiştir
Genetiği değiştirilmiş MSC'ler (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)	Bu hücreler önceki çalışmamızdan elde edilmiştir: Ye ve ark. (hazırlık aşamasında)
Normal eşek serumu (NDS)	Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)	017-000-121
Paraformaldehit (PFA)	Fisher Scientific (Hampton, NH)	O4042	0.1M PO4 tamponunda %4 PFA
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P4417
Triton X-100	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	X100
ImageXpress Mikro	Moleküler cihazlar (Sunnyvale, CA)	ImageXpress micro	Yüksek içerikli tarama sistemi
MetaXpress 4.0	Moleküler cihazlar (Sunnyvale, CA)	MetaXpress 4.0	Görüntü elde etme ve analiz yazılımı
KH₂PO₄	Fisher Scientific (Hampton, NH)	PO₄ tamponu için	P285
K₂HPO₄	Fisher Scientific (Hampton, NH)	P288	PO₄ tamponu için

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission