Analjezik İlaçların İntrakraniyal ve İntraperitoneal Uygulamasının Bir Sıçanda Termal Ağrı Yanıtı Üzerine Sinerjik Etkisi

Özet

Kaynak: Martinez, E., et al. Kemirgenlerde intrakraniyal farmakoterapi ve ağrı testleri. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, prefrontal kortekste önceden implante edilmiş bir kılavuz kanül ile anestezi uygulanmış bir sıçanda analjezik bir ilacın intrakraniyal uygulamasını göstermektedir. Ek bir analjezik ilaç intraperitoneal olarak birlikte uygulanır. İyileşmeyi takiben, sıçanın termal ağrı tepkisi, uygulanan ilaçların analjezik etkilerini değerlendirmek için pençe çekme gecikmesinin ölçüldüğü Hargreave aparatı kullanılarak değerlendirilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Stereotaksik Kanül İmplantasyonu:

1. 10-12 haftalık erkek Sprague-Dawley sıçanları kullanın.
2. Hayvanları %1.5-2 izofluran ile uyuşturun. Hayvan keskin forsepslerle güçlü bir çimdiklemeye tepkisiz hale geldiğinde, ameliyatı gerçekleştirin. Hasarı önlemek için tüm aletleri otoklavladığınızdan, steril cerrahi eldiven kullandığınızdan ve hayvanın gözlerine oftalmik merhem eklediğinizden emin olun.
3. Bilateral 26 gauge kılavuz kanülleri prefrontal kortekse (PFC) 12.5 derecelik bir açıyla 12.5 derecelik bir açıyla implante edin koordinatlar anteroposterior (AP): +2.9 mm; mediolateral (ML): +/−1.6 mm; dorsoventral (DV): -2.1 mm. Kanülleri yerleştirmek için, kullanılan kanüllerin boyutuna göre bir delik çapı ile kafatasına istenen koordinatlarda delikler açın.
   NOT: Burada, PFC, daha önceki bir dizi çalışmada gösterilmiş olan ağrı işlemedeki önemli rolü nedeniyle intrakraniyal implantlar için potansiyel hedef olarak incelenmiştir. Diğer belirli beyin bölgelerinin işlevini incelemek için, araştırmacılar beyin atlasına göre farklı koordinatlar kullanabilirler.
4. Sıçanların en az 1 hafta ameliyattan sonra iyileşmesine izin verin. Ameliyattan sonra, metabolik gereksinimleri desteklemeye yardımcı olmak için iyileşmeden önce deri altı sıvıları enjekte edin ve yeni kapatılmış insizyona topikal bupivakain uygulayın. Hayvanı uyanana kadar ılık bir ped üzerine koyun ve sağlık ve uygun bir iyileşme sağlamak için hayvan operasyonu sonrası 3 gün boyunca izleyin.
5. Hayvanlar ameliyattan tamamen iyileştikten sonra enjeksiyonlara başlayın (bir sonraki adım).

2. İntrakraniyal ve İntraperitoneal Enjeksiyonlar

1. İntrakraniyal enjeksiyonlar için, implante edilen kılavuzların 1,0 mm ötesine uzanan 33 gauge enjektör kanülü ile 10 μL Hamilton şırıngalarına bir ucundan bağlı PE-50 hortumu kullanın.
2. Bu sıçanların PFC'sine çalışma ilacından veya salinden 0.5 μL (veya istenirse daha az) enjekte edin. PFC sıçanlarda daha geniş bir bölge olduğundan, bu miktar diğer bölgelere yayılmayacaktır. Bununla birlikte, daha küçük beyin bölgeleri veya fareler için daha küçük bir hacim kullanın. Enjekte edilen miktar, beynin bölgesine ve hayvan türüne bağlı olacaktır.
   NOT: DMSO nörotoksik olduğu için kontrol olarak dimetil sülfoksit (DMSO) yerine salin kullanılması gerektiğini lütfen unutmayın. Bununla birlikte, çok az miktarda DMSO infüzyon için güvenli olabilir, çünkü çalışmalar% 50'den daha az DMSO'nun (yani, bu durumda olduğu gibi toplam 0.3 μL'den daha az) davranış çalışmalarına müdahale etmeyebileceğini göstermiştir.
3. Hacmi 100 s'lik bir süre boyunca bilateral olarak enjekte edin ve bu çözeltinin yavaş difüzyonunu sağlamak için çıkarmadan önce enjektör kanüllerini 60 saniye daha yerinde tutun.
4. Sinerjik farmakolojik etkilerle ilgili çalışmalar için, sistemik yöntemlerle başka bir ilacı birlikte uygulayın. Bu durumda, istenen ilacı veya kontrolü intrakraniyal olarak enjekte edin ve hemen ardından intraperitoneal olarak ek bir ilaç uygulayın. Örnek olarak, bu çalışmada, ilave bir etkiyi test etmek için morfin ve Ampakinlerin sinerjik analjezik etkilerini inceledik. 1 mg / kg morfin (güvenli bir sistemik doz) intraperitoneal iletimi ile kombinasyon halinde intrakraniyal olarak bir AMPAkine infüze ettik.
   NOT: İntraperitoneal enjeksiyonlara göre daha zor olduğu için önce intrakraniyal enjeksiyonların yapılması önerilir.

3. Analjezi Testleri ve Değerlendirmesi

1. İntrakraniyal enjeksiyonların sıçanlarda akut ağrı davranışı üzerindeki etkisini incelemek için, termal uyaranlara yanıt olarak geri çekilme gecikmesini hesaplamak için plantar testi (Hargreaves testi) kullanın. Hargreaves'in aparatı, bir cam düzlemden bir kızılötesi ışını farenin ayağına odaklar; Sıçan ayakta duruyor ve cam düzlemin üzerinde serbestçe hareket ediyor. Hargreaves testini gerçekleştirirken, kızılötesi ışını farenin ayağının plantar alanının altına odaklayın.
   1. Karşılaştırma için bir temel değer oluşturmak için enjeksiyonlardan önce temel Hargreaves testlerini gerçekleştirerek başlayın.
2. Bir temel değer belirlemeden önce herhangi bir ilaç enjekte etmeyin. 5 dakika arayla beş iyi deneme yapın. İyi bir deneme, net bir geri çekilme ile gösterilir, yani sıçan dizini büktüğünde ve ayağını yukarı ve vücuda kaldırdığında.
   NOT: Sıçanın hassaslaşmasını önlemek için denemelerin 5 dakika aralıklı olduğundan emin olun. Hargreaves'in cihazı, kızılötesi ışın kırıldığında geri çekilme zamanını otomatik olarak kaydeder. Sonuç olarak, hareket, değişen ağırlık vb. İndirimli bir deneme gerçekleşirse, 5 dakika bekleyin ve denemeyi tekrarlayın.
3. Beş denemenin ortalamasını alarak para çekme eşiklerini hesaplayın.
4. Bir temel ortalama elde ettikten sonra, ilaçların infüzyonundan sonra çekilme sürelerini elde etmek için deneye başlayın. Hargreaves testleri intrakraniyal enjeksiyonlardan 20-30 dakika sonra yapılabilir, ancak kesin zamanlama spesifik ajanların farmakokinetiğine bağlı olabilir. Bu, sıçanın ilacı emdiğinden ve etkilerini yaşadığından emin olmak içindir. Bu deneyi adım 3.1 ile aynı şekilde gerçekleştirin.
5. Adım 3.2'de belirtildiği gibi para çekme eşiklerini hesaplayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sterotaxic Canül	PlasticsOne	8I26GA8MMKIT
Dijital Şırınga	Hamilton	8440
AMPAkine	Sigma Aldrich	C-271
Dimetil Sülfoksit	Sigma Aldrich	D4540
Hargreaves Aparatı	Ugo Basile	37370
Erkek Sprague-Dawley sıçanları	Taconic Farms	NTac:SD
Steril Cerrahi eldiven	Dynarex	6535