$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hayvanın Ameliyata Hazırlanması
- Cerrahi prosedürleri temiz ve özel bir alanda gerçekleştirin. Tüm cerrahi aletleri otoklavlayın ve ameliyattan önce cam boncuk sterilizatörü ile sterilize edin.
NOT: Bu protokolde doğum sonrası 10-12. gün (P10-12) FVB fareleri kullanın. Belirli bir projenin ihtiyaçlarını karşılamak için farklı yaşlarda ve fare türleri kullanılabilir. P40'tan daha eski fareler zor olabilir çünkü bulla kemiği sertleşir. - Fareleri, ketamin hidroklorür (100 mg / kg), ksilazin hidroklorür (10 mg / kg) ve asepromazin (2 mg / kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Cerrahi hazırlığa ancak hayvan artık ayak parmağı sıkışması gibi ağrılı uyaranlara yanıt vermedikten sonra başlayın. Gerekirse, orijinal anestezik düzlemi eski haline getirmek için anestezik kokteylin bir rapel dozunu (orijinal dozun beşte biri) uygulayın.
NOT: Bu yaşta gözlenen mortalitenin çoğu anestezik aşırı dozdan kaynaklandığı için bu adımda dikkatli olun. - Anestezi sırasında gözleri nemli tutmak için hayvanın gözlerini koruyucu bir oftalmik merhem ile örtün ve hayvanın göz kırpma refleksini bastırın.
- Anestezi sonrası hipotermiyi önlemek için, fareyi tamamen uyanana kadar işlem boyunca boynu bir ısıtma yastığına uzatılmış olarak konumlandırın.
- Sol kulak sonrası bölgeyi bir makasla tıraş edin ve cerrahi manipülasyondan önce% 70 etanol ve povidon-iyot ile dezenfekte edin.
2. Cerrahi Prosedür ve Vektör Enjeksiyonu
:
- Timpanik bülü ortaya çıkarmak için kulak sonrası bir yaklaşım kullanın. Kulak sonrası kası ortaya çıkarmak için deri altı dokusunu küçük bir makasla kesin. Yağ dokusunu insizyonun arka tarafına geri çektikten sonra, temporal kemiği ortaya çıkarmak için kesiye dik olan sağ ve sol taraftaki kasları ayırın. Bu kesiğin yeterli görselleştirme ile rahatça çalışacak kadar uzun olduğundan emin olun.
- Timpanik bülleri 25 G'lik bir iğne ile delin ve kokleanın bazal dönüşüne erişim sağlamak için kemiği geri soyarak forseps ile deliği gerektiği gibi genişletin ve ardından stapedial arteri ve yuvarlak pencere zarını (RWM) görselleştirmek için yeterince genişletin.
- RWM'yi bir borosilikat kılcal pipet ile merkezden nazikçe delin. Bu noktada RWM'den sıvı akışını gözlemleyin; Bu normal. Akıntı stabilize olana kadar bekleyin (kokleadan sızan sıvı steril bir filtre kağıdı ile kurutulur).
NOT: Cam iğneyi tutarken ve ilerletirken RWM perforasyonunun mümkün olduğunca küçük olmasına dikkat edin. Kullanılan mikroskoba bağlı olarak, pipetleri bir mikromanipülatör kullanarak veya bir pipet tutucu kullanarak elle tutun. - Pipetleri, yama kelepçeli pipetlerin hazırlandığı şekilde bir pipet çektirme kullanarak enjeksiyona hazırlayın. Uç çapının büyük olduğundan emin olun (yaklaşık 15 μm çapında), böylece virüsün içeri ve dışarı pipetlenmesi kolayca yapılır.
- Bir enjeksiyon pipetine 1 ila 2 μl adeno ilişkili virüs (AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP veya AAV2-GFP) çekin. Akış stabilize edildikten sonra (5 ila 10 dakika), bu sabit hacmi daha önce RWM'de yapılan aynı delikten skala timpaniye mikroenjekte edin.