Bir fare beyninde insan nöral progenitör hücrelerinin in vivo biyolüminesans görüntülemesi

Özet

Kaynak: Weber, R. Z., et al., Fare Beynindeki İnsan Nöral Progenitör Hücrelerinin İntraserebral Transplantasyon ve İn Vivo Biyolüminesans İzleme. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, bir fare beynine enjekte edilen genetik olarak değiştirilmiş insan nöral progenitör hücrelerinin in vivo biyolüminesans görüntüleme yöntemini göstermektedir. İşlem, lusiferin enjeksiyonu, görüntüleme hazırlığı ve enjeksiyon bölgesinde nakledilen hücrelerden biyolüminesan sinyallerin tespit edilmesini içerir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

İn vivo görüntüleme

1. Luciferin
   1. D-lusiferin potasyum tuzunu oda sıcaklığında (RT) çözdürün ve PBS'de 30 mg / mL'de taze bir D-lusiferin stok çözeltisi hazırlayın.
   2. Stok çözeltisini 0,22 μm'lik bir şırınga filtresi ile sterilize edin.
      NOT: Çalışma solüsyonunun hemen kullanılması önerilir. Gerekirse, çözünmüş lusiferin -20 °C'de saklanabilir. Ancak, uzun süreli depolama, sinyalin bozulmasına neden olabilir. Luciferin, ışığa duyarlı bir reaktiftir; Mümkün olduğunca doğrudan ışıktan uzak tutun. Çözünürlük sınırını iyileştirmek için alternatif substratlar, örneğin sikluk da düşünülebilir.
2. Imaging
   1. İlk kurulum
      NOT: Biyolüminesans görüntüleme, karanlık bir oda ve soğutulmuş şarj bağlantılı cihaz (CCD) kameradan oluşan bir in vivo görüntüleme sistemi (Malzeme Tablosuna bakın) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
      1. Living Image yazılım simgesini çift tıklatın ve açılır listeden bir kullanıcı kimliği seçin.
      2. Görüntülenen kontrol panelinde Başlat'a tıklayın. Başlatma işlemi tamamlandığında, kontrol panelindeki sıcaklık kutusu yeşile dönecektir.
      3. Kontrol panelinde, Lüminesan ve Fotoğraf kutularını işaretleyin ve Otomatik pozlama (~60 s) öğesini seçin. Bir görüş alanı seçin (bu protokol için D/12,5 cm seçilmiştir). Konu yüksekliğini (1,5 cm) girin ve konu yüksekliği odağını kullan seçeneğini belirleyin. Aşağıdaki parametreleri manuel olarak ayarlayın: büyük gruplama, f/2, tıkalı uyarma filtresi ve açık emisyon filtresi.
   2. 300 mg / kg vücut ağırlığında D-lusiferin enjeksiyon miktarını belirleyin.
      NOT: Standart önerilen doz 150 mg / kg D-lusiferindir. Bu prosedür, 300 mg / kg kullanılarak daha yüksek duyarlılık bildiren bir protokole göre ayarlandı.
   3. Lusiferini intraperitoneal olarak enjekte edin (i.p.).
      NOT: Hayvanın enjeksiyondan önce sakinleştirilmesi gerekiyorsa, bunun pik lusiferaz ekspresyon süresini uzatabileceğini unutmayın.
   4. 5 dakika bekleyin, ardından hayvanları sürekli bir izofluran kaynağı ile uyuşturun (görüntüleme prosedürü sırasında indüksiyon fazında% 4.5 ve bakım fazında% 1.5-2).
   5. Gözlere oftalmik kayganlaştırıcı sürün, ardından geleneksel bir saç tıraş makinesi kullanarak baş bölgesindeki sedasyonlu hayvanları tıraş edin. Hayvanları görüntüleme odasına yerleştirin ve lusiferin enjeksiyonundan 15 dakika sonra kontrol panelindeki Al'a tıklayarak görüntülemeye başlayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sarf malzemeleri
Şırınga filtresi; 0.22 μm	TPP	99722
Ekipman
Isıtma yastığı			Tercih edilen ürün
: In-Vivo görüntüleme sistemi (Living Imaging 4.2 yazılım paketine sahip IVIS Lumina III)	Perkin Elmer	CLS136334
İzofluran buharlaştırıcı	Provet AG	330724
Farmasötikler ve Reaktifler
D-Luciferin Potasyum Tuzu	Perkin Elmer	122799
Etanol; %			Tercih edilen ürün
İzofluran (İzofluran (1-Klor-2,2,2-trifloretil-diflorometileter) %99,9)	Provet AG	Tüm ilaçlar Zürih, İsviçre
Oftalmik kayganlaştırıcı (Retinol palmitat: 15.000 UI)	Bausch & Lomb Swiss AG	Tüm ilaçlar İsviçre'nin Zürih kentindeki kanton eczanesi tarafından sağlandı

70 kanton eczanesi tarafından sağlanmıştır.