$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. İntrahipokampal hücre nakli
NOT: Bu bölümdeki tüm adımlar, hayvan tesisindeki hücre kültürü davlumbazının dışında gerçekleştirilir. Hücrelerin beyne erken postnatal transplantasyonu, doğum günü P0 dikkate alınarak P2'de gerçekleştirildi.
- Aşağıdaki adımları izleyerek transplantasyon deneyine hazırlanın.
- Tüm cerrahi malzemeleri otoklavlayın veya mümkün değilse, onaylanmış başka bir yöntemle sterilize edin.
- Enjeksiyon şırıngasını herhangi bir cam kılcal damar olmadan tutucuya monte edin. İğneyi suyla durulayın.
NOT: İğne 33 G olmalıdır. - 30 G insülin iğnesinin ucunu 90° bükün.
- Yavru köpeği başı düz olacak şekilde konumlandırmak için ev yapımı Play-Doh benzeri bir sahne oluşturun (Şekil 1A).
- Yeni ortama alışmalarını sağlamak için ameliyat için herhangi bir şey hazırlamadan önce fare kafesini anne ve yavrularla birlikte getirin.
- İzofluran için ıslak buzlu bir tepsi ve biraz kağıt içeren boş bir kafes hazırlayın.
- Fare yavrusunu uyuşturun.
- Bir kağıt parçasını izofluran ile ıslatın (Malzeme Tablosuna bakın) ve boş kafesin içine yerleştirin. Dikkatlice bir yavru alın ve kağıdı izoflurana batırılmış olarak kafese koyun.
NOT: Annenin yanında asla üçten az yavru bırakmayın. 20-30 s'lik izofluran anestezisini aşmayın, aksi takdirde yavru ölebilir. - Anestezinin etkisini hareket durdurma ile doğrulayın.
- Anesteziden hemen sonra, yavruyu ıslak buz yüzeyindeki ıslak bir dokuya yerleştirin. Üst uzuvları beyazımsı hale gelene kadar hayvanı 3 dakika buz üzerinde tutun (Şekil 1B, mavi ok). Bu genellikle 2-3 dakika sürer.
- Şırıngayı hücre süspansiyonu ile yüklemek için bu süreyi kullanın. Hücreleri önce bir pipetle dikkatlice yeniden süspanse edin.
- Yavruyu stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Kulak çubuklarını ters yönde kullanın (Şekil 1A, macenta oklar).
NOT: Kulak çubuklarının arka tarafı daha az sivridir ve P2 yavrularının kulakları olmadığından, hayvana zarar vermemek için daha düz tarafı kullanın. - Yandan başın düz olup olmadığını kontrol edin. Baş düz olmalıdır; buna uyum sağlamak için Play-Doh benzeri sahneyi kullanın.
NOT: Bu yaştaki yavrular henüz gözlerini açmamıştır, bu nedenle bu konuda ek bir adım atılmasına gerek yoktur. Yavruların bu yaşta kürkleri yoktur, bu nedenle bölgenin tıraş edilmesine gerek yoktur. Cilde açık bir kesi olmadığı için spesifik bir ağrı tedavisi verilmez ve dikiş atılmaz. - Ameliyatın tüm süresi boyunca yavruyu buzla (kağıt mendilin üstünde) kapalı tutun.
NOT: Buzu yavrunun cildiyle doğrudan temas edecek şekilde yerleştirmeyin.
- Enjeksiyonu gerçekleştirin.
- Etanole batırılmış yumuşak bir doku kullanarak cildin yüzeyini temizleyin.
- Lambda'yı tanımlayın ve stereotaksik aletin dijital ekran konsolunda koordinatları sıfıra ayarlayın (Şekil 1C, sarı kesikli çizgi). Sagital ve lambdoid sütürler kırmızı çizgiler halinde vaskülarize oldukları için gözle kolayca görülebilirler.
NOT: Lambdayı görselleştirmede zorluk yaşıyorsanız, cildinize küçük bir buz parçası koyun ve soğuması için birkaç dakika bekleyin. Ardından, buz parçasını çıkarın ve cildin ince beyazlatılması görselleştirmenize izin verecektir. - Enjeksiyon iğnesini istenen koordinatlara yeniden yerleştirin. Tarif edilen protokolde hedeflenen bölge hipokampus idi ve koordinatlar şu şekildeydi: ön-arka (AP) +0.85 ve medio-lateral (ML) +1.35.
- Kafatasına nüfuz etmek ve küçük bir delik oluşturmak için 90 ° bükülmüş bir insülin iğnesi kullanın.
- Enjeksiyon iğnesini kafatasını geçene kadar aşağı indirin ve dorso-ventral (DV) koordinatlarını sıfırlayın. İstenen DV koordinatlarına gelene kadar iğneyi indirin. Açıklanan protokolde koordinatlar DV -1.1 idi.
- Önceden belirlenmiş zaman aralıklarına göre enjekte edin.
NOT: Açıklanan protokolde tam zamanlamalar şu şekildeydi: (i) DV koordinatına indikten sonra 3 dakika bekleyin, (ii) 5 dakika boyunca 1 μL hacim enjekte edin ve (iii) tüm hacim enjekte edildikten sonra 3 dakika bekleyin. - İğneyi yavaşça geri çekin.
- Prosedürü sonlandırın.
NOT: Yavrunun hayatta kalmasını sağlamak ve anesteziden hipotermi ile kaynaklanan herhangi bir hasarı önlemek için ameliyat 15 dakikadan fazla süremez. - Yavruyu anneye geri vermeden önce hareket etmeye başlayana kadar elleriyle ısıtın.
- İn vivo hücre farklılaşmasına devam etmek için transplantasyondan en az 2 gün önce ve 3 hafta sonra (PT) içme suyu olarak% 0.5 sükroz çözeltisinde 1 mg / mL konsantrasyonda DOX verin.
