Fare Kortikal İnternöron Progenitörlerinde Agaroz Gömülü Elektroporasyon Destekli Gen Transferi

1. Focal DNA injections
   ifade
   1. vektörlerinin bir deoksiribonükleik asit (DNA) karışımını hazırlayın: pCAGGs-IRES-GFP (kontrol vektörü) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, her vektör için 1 μg/μL konsantrasyonda. 1/10 seyreltmede hızlı yeşil çözelti (stok 25 mg / mL) ekleyin.
   2. Çekilmiş bir cam mikropipeti (0,5 mm iç çap ve 1 mm dış çap) 10 μL DNA karışımı ile doldurun ve dilimin seçilen bölgesine (Medial Ganglionik Eminence veya MGE/Kaudal Ganglionik veya CGE) küçük miktarlarda (25-50 nL aralığında) enjekte edin (Şekil 1 ve Şekil 2).
2. Akut elektroporasyon
   NOT: Elektroporasyon, fokal DNA enjeksiyonundan hemen sonra yapılmalıdır.
   1. Küçük agaroz bloğunu Petri kabı elektroduna yerleştirin ve agaroz sütununu düz uçlu bir mikro spatula kullanarak mobil kapak elektroduna takın.
   2. Dilimi destek zarı ile birlikte agaroz bloğuna aktarın ve agaroz sütunu ile üst elektrodu dilimin seçilen bölgesinin (MGE/CGE) üzerine yerleştirin.
      NOT: 125 V'luk şarj voltajları (her biri 5 ms'lik iki darbe, aralık 500 ms) başarılı bir elektroporasyon sağlayacaktır (Şekil 3).
3. Elektroporasyondan sonra, dilimi destekleyici zarı ile birlikte tabağa yerleştirin ve 37 ° C'de bir CO₂ doku kültürü inkübatörüne aktarın.

Şekil 1: Akut elektroporasyon deneyleri için kullanılan temsili telensefalik dilimler. (A-C) Telencefalik dilimler, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile boyanmış üç farklı ardışık rostrokaudal seviyede elde edildi. LGE: lateral ganglionik üstünlük; MGE: medial ganglionik üstünlük; CGE: kaudal ganglionik üstünlük. Ölçek çubukları = 200 μm. Sarı yıldızlar, her dilimdeki elektroporasyon bölgesini gösterir. Beyaz çizgi, ganglionik üstünlüğün kenarını işaretler.

Şekil 2: Deneysel iş akışının şematik gösterimi. (A) Fare beyin dilimleri uygun yapılarla elektroporasyona tabi tutulur ve (B) 12 saat sonra, modifiye kortikal internöron (CI) öncüleri izole edilir ve (C) yeni doğan fare yavrularının palyumuna nakledilir (P0−P2). Olgunlaşmamış Kİ'lerin aktivitesini değiştirmek için, hücre nakli yapılan P14 yavrularına, sunulan protokole göre dört kurucu gün boyunca CNO veya araç enjekte edildi. (Bir') Akut fare beyin dilimi elektroporasyon kurulumunun fotoğrafı.

Şekil 3: Temsili başarılı akut dilim elektroporasyon deneyi. (A) Bir E14.5 embriyo beyninden temsili koronal kesit, hem pCAGGs-IRES-GFP (Yeşil floresan proteini) hem de pCAGGs-hM3D (Gq)-IRES-RFP (Kırmızı floresan protein) plazmitleri ile CGE'de transfekte edildi ve 12 saat boyunca kültürlendi. Kesit GFP (A, B, C) ve RFP (A, B, D) için immün boyalıdır. Panel A'daki kutulu alan, hem floresan raportörlerin (B), hem GFP'nin (C) hem de yalnızca RFP'nin (D) ifadesini gösterecek şekilde büyütülür. Beyaz çizgi, ganglionik üstünlüğün kenarını işaretler. B-D: aynı fotoğraf, farklı kanallar veya iki farklı kanalın birleşimi. Ölçek çubukları = 200 μm (A), 100 μm (BD).