Fare Kortikal İnternöron Progenitörlerinde Agaroz Gömülü Elektroporasyon Destekli Gen Transferi

Özet

Kaynak: Denaxa, M., el al., Kemogenetik Olarak Tasarlanmış Kortikal İnternöron Progenitörlerinin Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Nakli. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, ilgilenilen geni taşıyan bir plazmit vektörünün embriyonik bir beyin dilimindeki internöron progenitörlerine enjekte edilmesi ve ardından plazmit girişi ve gen ekspresyonu için elektroporasyon prosedürünü göstermektedir. Bu modifiye edilmiş progenitörler daha sonra beyin bozukluklarını tedavi etmek için kullanılabilir.

Protokol

1. Focal DNA injections
   ifade
   1. vektörlerinin bir deoksiribonükleik asit (DNA) karışımını hazırlayın: pCAGGs-IRES-GFP (kontrol vektörü) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, her vektör için 1 μg/μL konsantrasyonda. 1/10 seyreltmede hızlı yeşil çözelti (stok 25 mg / mL) ekleyin.
   2. Çekilmiş bir cam mikropipeti (0,5 mm iç çap ve 1 mm dış çap) 10 μL DNA karışımı ile doldurun ve dilimin seçilen bölgesine (Medial Ganglionik Eminence veya MGE/Kaudal Ganglionik veya CGE) küçük miktarlarda (25-50 nL aralığında) enjekte edin (Şekil 1 ve Şekil 2).
2. Akut elektroporasyon
   NOT: Elektroporasyon, fokal DNA enjeksiyonundan hemen sonra yapılmalıdır.
   1. Küçük agaroz bloğunu Petri kabı elektroduna yerleştirin ve agaroz sütununu düz uçlu bir mikro spatula kullanarak mobil kapak elektroduna takın.
   2. Dilimi destek zarı ile birlikte agaroz bloğuna aktarın ve agaroz sütunu ile üst elektrodu dilimin seçilen bölgesinin (MGE/CGE) üzerine yerleştirin.
      NOT: 125 V'luk şarj voltajları (her biri 5 ms'lik iki darbe, aralık 500 ms) başarılı bir elektroporasyon sağlayacaktır (Şekil 3).
3. Elektroporasyondan sonra, dilimi destekleyici zarı ile birlikte tabağa yerleştirin ve 37 ° C'de bir CO₂ doku kültürü inkübatörüne aktarın.

Sonuçlar

Şekil 1: Akut elektroporasyon deneyleri için kullanılan temsili telensefalik dilimler. (A-C) Telencefalik dilimler, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile boyanmış üç farklı ardışık rostrokaudal seviyede elde edildi. LGE: lateral ganglionik üstünlük; MGE: medi...

Malzemeler