Spinal ve Bulbar Kas Atrofisi Fare Modelinde Rekombinant Adeno İlişkili Vektörlerin Enjekte Edilmesi

Özet

Kaynak:
Pourshafie, N., et al. Kemirgenlerde nöromüsküler hastalıkları tedavi etmek için rekombinant adeno ile ilişkili virüs serotip 9 kullanılarak mikroRNA'nın sistemik dağıtımı. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu videoda, spinal ve bulbar kas atrofisi veya SBMA'dan etkilenen bir fare, terapötik mikroRNA'yı kodlayan bir plazmid taşıyan rekombinant AAV (Adeno ilişkili vektörler) vektörlerinin kuyruk veni enjeksiyonuna tabi tutulur. Vektör, mutant AR (Androjen reseptörü)-mRNA'ya (haberci ribonükleik asit) bağlanan ve bozulmasını tetikleyen mikroRNA üretir. Bu, toksik protein birikimini azaltır ve nöromüsküler fonksiyonun iyileştirilmesine yardımcı olur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. AAV-miRNA Plazmidinin Kuyruk Ven Enjeksiyonu

NOT: Bu adımın hedef gene ve farelerin yaşına ve ağırlığına göre ayarlanması gerekir. Farelerin yaşına ve ağırlığına göre doz aralığını, hacmini ve en iyi uygulama yolunu belirlemek için Kurumsal ve Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerini kullanın. Hedef dokulardaki GFP (Yeşil floresan protein) floresan sinyali ve miRNA ekspresyon seviyelerinin enjeksiyondan 2 hafta sonra başlayarak zirve yapması beklenir. Aşağıdaki protokol, erken yetişkinlik dönemindeki erkek farelere atıfta bulunur. AAV, Biyogüvenlik Seviye 1 yönergeleri kapsamında bir biyolojik tehlike olarak ele alınmalıdır.

1. Steril fosfat tamponlu salin (PBS) kullanarak mL (vg/mL) başına 10^10-10 11 viral genom viral yükü içeren 100-200 μL'lik alikotlara AAV-miRNA plazmit stoğunu bölün. AAV solüsyonunu işlemek için laboratuvar biyolojik tehlike kişisel koruyucu ekipmanı kullanılmalıdır.
   NOT: Bir alikot çözüldükten sonra 4 °C'de iki haftaya kadar saklanabilir. Viral stok -80 °C derin dondurucuda saklanabilir.
2. Fareyi, uygun boyutta plastik veya konik plastik film tüpü gibi piyasada bulunan kısıtlayıcılarda tutun.
3. Kuyruğun yüzeyini% 70 alkollü mendillerle temizleyin.
4. Vazodilatasyonu artırmak için kuyruğun altında 30 saniye boyunca ılık bir ped (28-30 °C) tutun. Alternatif olarak, hayvanları kırmızı bir ısı lambası kullanarak (2-3 fit mesafede) veya kuyruğu ılık suya batırarak ısıtın.
5. Kuyruğun distal kısmından başlayarak, viral alikot yüklü iğneyi (27-30 G), kuyruktan 15° yukarı doğru eğim vererek damara sokun. Enjeksiyondan önce iğnenin doğru yerleştirildiğinden emin olun.
   1. Enjeksiyon sırasında direnç hissedilirse veya cilt altında şişlik görülürse işlemi durdurun. İğneyi çıkarın ve önceki enjeksiyon bölgesinin üzerine tekrar yerleştirin.
      NOT: Alternatif olarak, bu, iğneyi nazikçe aspire ederek ve kanı gözlemleyerek elde edilebilir. Sert aspirasyon kuyruk damarını çökertebilir. Enjeksiyon sırasında damar beyazlarsa, iğne doğru şekilde yerleştirilir.
6. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, iğneyi kaldırmadan önce birkaç saniye bekleyin.
7. Enjeksiyon bölgesinde kanama olup olmadığını gözlemleyin. Kanama durana kadar bölgeye iki parmağınızı kullanarak orta derecede basınç uygulayın.
8. Hayvanı kafesine geri koyun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Scale	Pelouze	SP5
Nalgene kova	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
Mikrosantrifüj tüpü	USA Scientific	1615-5500
Laktasyonlu Zil Çözüm	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini vortekser	Fisher Scientific	128101
Santrifüj	Eppendorf	22624415
Laboratuvar filmi	Bemis	PM996
1 mL şırınga	BD	309626	25 g'lık bir iğne takılı olarak gelir. Enjeksiyon için 27-30g iğne ile değiştirin
30g iğne	BD	305106
Isofluran	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isofluran USP 250 mL
Anestezi maskesi	Kopf Instruments	906
Gazlı Bez	Henry Schein	100-2524	2 "x 2" (5cm x 5cm)
Pipet uçları	USA Scientific	1111-0816
Mikropipet	Gilson	4642080
Gaz anestezi buharlaştırıcı	SurgiVet	4214322	Classic T3
Gaz anestezi çöpçüsü	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Isıtma yastığı	Sears	17280
Tezgah pedi	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/ Harvard Aparatı	76-0772	4 sıçan / 4 fare
70 Etanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 kanıt
%70 İzopropanol	VWR	89108-160

%