Bir fare modelinde bağırsak kaynaklı mikrobiyal metabolitlerin intrakraniyal enjeksiyonu

Özet

Kaynak: Liou, C. et al. Serbest Hareket Eden Farelerde Bağırsak Kaynaklı Mikrobiyal Metabolitlerin İntraserebroventriküler Dağıtımı. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, beyin aracılı davranış üzerindeki etkilerini incelemek için serbestçe hareket eden bir farede kısa zincirli yağ asitlerinin (SCFA'lar) intrakraniyal enjeksiyonunu göstermektedir. Fare beynine implante edilen bir kılavuz kanüle bir enjektör kanülü yerleştirilir. İyileştikten sonra, fare yeni bir kafese alışır. Daha sonra SCFA'lar uygulanır ve lokomotor davranış kaydedilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Deney hayvanı için hazırlık

1. : Bir satıcıdan 6-8 haftalık vahşi tip C57BL / 6JNarl erkek fareler edinin.
2. Fareleri, standart fare yemi ve sterilize edilmiş su ad libitum ile standart bir fare kafesine yerleştirin.
   NOT: Laboratuvar Hayvanları Merkezi için barınma koşulları 22 ± 1 °C sıcaklık, %55 ± %10 nem ve 13 saat/11 saat aydınlık/karanlık döngüsüdür.

2. Stereotaksik cerrahi

1. Stereotaksik aleti, cerrahi aletleri ve ilgili öğeleri hazırlayın ve sterilize edin.
   NOT: Cerrahi bölgeye doğrudan temas edecek tüm öğeler, enfeksiyonu önlemek için sterilize edilmelidir.
2. Fareyi oksijen içinde %1-%5 izofluran içeren Pleksiglas kafese yerleştirerek uyuşturun.
   NOT: Solunum hızının saniyede yaklaşık bir nefeste tutulduğundan emin olmak için fareyi yakından gözlemleyin.
3. Fareyi anestezi odasından çıkarın. Ameliyat bölgesini (fare kafası) bir evcil hayvan düzeltici ile tıraş edin. Fare kesici dişlerini stereotaksik kesici alet tutucusundaki kesici çubuk üzerine sabitleyerek fareyi stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Burnu nosekon maskesi ile örtün.
4. Stereotaksik cerrahi boyunca fareyi oksijende% 1 -% 2.5 izofluran ile uyuşturun. Farenin nosisepsiyonunu ayak parmağı kıstırma refleksi ile değerlendirin ve cerrahi bölgeyi kesmeden önce sabit bir solunum hızı sağlayın.
5. Ameliyat sırasında vücut ısısını korumak için farenin altına stereotaksik çerçeve üzerine bir ısıtma yastığı (37.0 °C) yerleştirin. Alternatif olarak, programlanan ısıtıcıyı ve ısıtma yastığını birbirine bağlayan bir rektal termal prob yardımıyla çekirdek sıcaklığını koruyun.
6. Yapışkan bant kullanarak kafadaki kesilmiş kürkü çıkarın. Ağrıyı hafifletmek için fareye analjezik Ketoprofen (5 mg / kg) deri altına enjekte edin. Kuru gözleri önlemek için göz merhemi sürün.
7. Kafayı sabitlemek için sivri kulak çubuğunu kulak kanalına yerleştirin.
8. Kulak çubuğunun ölçeğini ayarlayarak kafayı ortalayın.
9. Dikey hareketi önlemek için kesici tutucudaki burun kelepçesini sıkın. Başın sabitlendiğini kontrol etmek ve sonraki ameliyat sırasında başın gevşemesini önlemek için kafaya hafifçe bastırın.
10. Bir pamuklu çubuk kullanarak kafa derisini üç alternatif klorheksidin fırçası ile dezenfekte edin. Her fırçalamaya ortadan dış tarafa doğru başlayın (en çok dezenfekte edilen merkezi alandan en az dezenfekte edilen alana kadar).
    NOT: Ortadan dışa doğru fırçalama kullanımı, bilim adamlarının kürkten kaynaklanan enfeksiyonu ve kontaminasyonu en aza indirmesine yardımcı olabilir. Dış alan, hala çok miktarda kürk içeren ve tamamen dezenfekte edilmesi kolay olmayan tıraşsız baş bölgesine yakındır.
11. Cerrahi bir bıçak kullanarak kafa derisini ön/arka şekilde (<1 cm) kesin. Kesiği açın ve kafatasını mikrodiseksiyon forsepsleri tarafından tutulan bir pamuklu çubukla silin.
    NOT: Mikrodiseksiyon forsepsleri, cerrahi bıçak ve pamuklu çubuklar ameliyattan önce otoklavlama ile sterilize edilmelidir. Cerrahi işlem sırasında, tüm cerrahi ekipmanı her hayvandan önce ve sonra en az 5 saniye boyunca bir cam boncuk sterilizatörü (150 °C) kullanarak sterilize edin. Cerrahi işlem sırasında ve hayvanlar arasında cerrahi bıçağı ve forsepsleri tutmak için sterilize edilmiş bir beher hazırlayın.
12. Kafatasındaki Bregma ve Lambda'yı tanımlayın. İlgilenilen bölgeyi bulmak için Bregma'yı referans olarak kullanın.
    1. İsteğe bağlı: Stereotaksik matkabı stereotaksik matkabı stereotaksik matkabın tutucusuna monte edin ve Bregma'yı referans olarak göstermek için matkabın ucunu kullanın. Stereotaksik matkabı cam boncuk sterilizatörü (150 °C) kullanarak en az 5 saniye sterilize edin.
13. Bregma/Lambda ile sol/sağ ve ön/arka düzlemlerde düz kafatası yatay düzlemini kalibre edin ve hizalayın.
    NOT: Doğru bir yatay düzlemde değilse, fareyi stereotaksik alete yeniden monte edin.

3. Ticari özelleştirilmiş kılavuz kanül implantasyonu

1. Stereotaksik koordinatlara göre sağ lateral ventrikülün konumunu tanımlayın ve etiketleyin: Bregma'ya olan mesafe, anterior/posterior (A/P): 0.26 mm, medial/lateral (M/L): -1.0 mm, dorsal/ventral (D/V): -2.0 mm.
   NOT: Koordinatlar, ilgilenilen bölgeye göre değiştirilebilir. Lateral ventrikül koordinatları, 26-30 g ağırlık aralığına sahip yetişkin C57BL / 6J farelere dayanıyordu.
2. Ticari bir kılavuz kanülün implantasyonu için stereotaksik bir matkap kullanarak etiketli bölgede kafatasından bir delik (çap = 1,5 mm) açın.
3. Paslanmaz çelik vidaların montajı için stereotaksik bir matkap kullanarak kafatasına iki ila dört delik daha (çap = 1,5 mm) açın.
   NOT: Stereotaksik matkabı bir cam boncuk sterilizatörü (150 °C) kullanarak her hayvandan önce ve sonra en az 5 saniye sterilize edin.
4. Kemik artıklarını silin ve pamuklu çubukla kanamayı durdurun.
5. Lokal anestezik, antipruritik ve ağrı giderici etkiler için pamuklu çubuk kullanarak kafatasını Lidokain (1 mg / kg) ile silin. Delme işleminden sonra kanama durmazsa, hemostaz için deliğe nazikçe bir pamuklu çubuk yerleştirin.
6. Dental akrilik için ankraj sağlamak için deliklere iki ila dört paslanmaz vida monte edin.
7. Ticari kılavuz kanülü stereotaksik kanül tutucusuna yerleştirin ve cam boncuk sterilizatörü (150 °C) ile dezenfekte edin.
   NOT: Ticari kılavuz kanül, ticari manken ve ticari enjektör (Şekil 1A), Malzeme Tablosunda gösterilen özelliklere göre özelleştirilmiştir.
8. Stereotaksik kanül tutucuyu lateral ventrikül için açılan deliğe hareket ettirin ve ticari kılavuz kanülü istenen derinliğe (2,5 mm) ulaşana kadar yavaşça deliğe sokun.
   NOT: Dorsal/ventral koordinat, uç deliğe zar zor sokulduğunda ticari kılavuz kanülün ucu referans olarak ayarlanarak tanımlanabilir.
9. Ticari kılavuz kanülü açılan deliğe sabitlemek için 10 μL n-bütil siyanoakrilat yapıştırıcı (doku yapıştırıcı yapıştırıcı) uygulayın ve 3-4 dakika bekleyin. Ticari kılavuz kanülünü stereotaksik kanül tutucusundan nazikçe çıkarın ve tutucuyu uzaklaştırın.
10. Ticari kılavuz kanülü sabitlemek için diş akriliğini kesilen kafa derisine uygulayın ve en az 5 dakika bekleyin. Kanülün kan veya vücut sıvısı ile tıkanmasını önlemek için ticari mankeni ticari kılavuz kanüle implante edin (Şekil 1B).
11. Kulak çubuğunu kulak kanalından serbest bırakın ve fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın.
12. Anesteziden kurtulmak için fareyi altında bir ısıtma yastığı bulunan yeni bir kafese yerleştirin ve fare tamamen uyanana kadar sürekli olarak gözlemleyin.
    NOT: Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Ameliyat geçiren bir hayvan, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların yanına geri dönmemelidir.
13. Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) protokolüne ve deney tasarımına bağlı olarak fareyi tek yuvaya veya grup yuvasına geri koyun. Grup konutu için, istenmeyen yaralanmaları veya kanülün ayrılmasını en aza indirmek için bir kafeste daha az farenin barındırıldığından emin olun.
14. Ameliyat sonrası bakım için en az 3 gün boyunca içme suyunda İbuprofen (0.2 mg / mL) uygulayın ve en az 3 gün boyunca ağrı ve sıkıntı belirtileri için günde iki kez izleyin.
    1. Ameliyat sonrası bakım sırasında, farelerde iltihaplanma ve enfeksiyonu önlemek için cildin etrafına roksitromisin merhem sürün.
    2. Hayvanın durumunu izlemeye devam edin ve yeterli enerji sağlamak için zamanında intraperitoneal %5 glikoz ve/veya %0.9 sodyum klorür enjeksiyonu yapın.
    3. Ağrı, sıkıntı veya enfeksiyon durumu giderek kötüleşirse, fareyi CO₂ soluma ile ötenazi yapın.
15. Farenin kısa zincirli yağ asitlerinin (SCFA'lar) intraserebroventriküler iletimi ve davranışsal testler için hazır olması için ameliyattan sonra 1 hafta bekleyin.

4. SCFA'ların Hazırlanması

1. Sodyum asetat, sodyum bütirat ve sodyum propiyonatı yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) içinde çözün (Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Kimyasalların tamamen çözündüğünden emin olun, ardından pH'ı 7,4'e ayarlayın ve SCFA karışımını sterilizasyon için 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.

5. Davranış testi sırasında SCFA'ların intraserebroventriküler iletimi için infüzyon sistemini kurun

1. Davranışı kaydetmek için bir tavan kamerası monte edin. Video kayıt yazılımını kontrol etmek için kamerayı bir bilgisayara bağlayın (Şekil 2).
2. 10 μL'lik bir şırıngayı damıtılmış su ile doldurun.
   NOT: Mikrolitre şırıngada hava kabarcıklarından kaçının.
3. Mikroenjeksiyon kontrolörü ile bir mikroenjeksiyon pompası bağlayın.
4. Mikrolitre şırıngayı mikroenjeksiyon pompasına monte edin. Şırıngayı takmak için, kelepçeyi gevşetmek için düğmeye basın ve şırıngayı ilgili konuma takın. cl'yi kapatınamp ve mikroenjeksiyon pompasındaki piston tespit vidasını sıkın (Şekil 3A).
5. Ticari enjektörü polietilen tüpe yerleştirin (Şekil 1A).
6. Polietilen tüpü test arenasının üzerindeki tavan kamerasına asın.
7. Polietilen tüpü bir insülin şırıngası kullanarak damıtılmış suyla doldurun. Mikrolitre şırıngayı asılı polietilen tüpe bağlayın.
   NOT: Polietilen tüpün, farenin test alanı boyunca serbestçe hareket etmesine izin verecek kadar uzun olduğundan emin olun.

6. Mikroenjeksiyon kontrol cihazının sistem ayarları Mikroenjeksiyon

1. kontrol cihazını açın ve Komut ekranına erişmek için Tüm Kanalları Görüntüle düğmesine basın (Şekil 3C). Yapılandırma'ya basın ve Hacim Hedefini 9.800 nL'ye, Teslimat Hızı ise 100 nL/s'ye ayarlayın. Mikrolitre şırıngaya bağlı polietilen tüpten 9.800 nL damıtılmış su demleyin (İnfüzyon moduna geçmek için Yön'e basın ve RUN'a basın) (Şekil 3C'deki Komut ekranındaki kırmızı karelere bakın).
2. Yapılandırma'ya basın ve Hacim Hedefini 3.000 nL'ye, Teslimat Hızı ise 100 nL/s'ye ayarlayın. 3.000 nL mineral yağ çekin (Para Çekme moduna geçmek için Yön'e basın ve RUN'a basın) (Şekil 3C'nin Komut ekranındaki kırmızı karelere bakın).
   NOT: Polietilen tüp üzerinde net bir yağ-su faz ayrımı gözlenmelidir.
3. Polietilen tüpü mikrolitre şırınga iğnesinden sökün. Mikrolitre şırınga iğnesinden 3.000 nL damıtılmış su tükürün (İnfüzyon moduna geçmek için Yön'e basın ve ÇALIŞTIR'a basın).
4. Mikrolitre şırıngayı tekrar polietilen tüpe yerleştirin. Yapılandırma'ya basın ve Hacim Hedefini 100 nL/sn Teslimat Hızı ile 9.500 nL olarak ayarlayın. 9.500 nL SCFA çekin (Para Çekme moduna geçmek için Yön'e basın ve ÇALIŞTIR'a basın). SCFA'ların başarılı bir şekilde infüze edilip edilmediğini doğrulamak için yağ-SCFA fazını etiketleyin.
5. Yapılandırma'ya basın ve Teslimat Hızı ile istenen Hacim Hedefini 7 nL/s olarak ayarlayın. İnfüzyon moduna geçmek için Yön'e basın (Şekil 3C'deki Komut ekranındaki kırmızı karelere bakın).
   NOT: İnfüzyon süresine göre hacmi belirleyin. Örneğin, 7 nL / s'lik teslimat hızı için infüzyon süresi 3 dakika ise, hedef hacim = 1.260 nL.
6. Enjektörü SCFA enjeksiyonu için kanüle yerleştirmeden önce mikrolitre şırıngayı ticari enjektörün ön ucundan sıvı çıkana kadar ileri doğru demlemek için RUN'a basın.

7. SCFA'ların serbestçe hareket eden bir farede ticari kılavuz kanül yoluyla lateral ventriküle infüzyonu

1. Fareyi, oksijende %1-%5 izofluran ile Pleksiglas kafese yerleştirerek uyuşturun.
   NOT: Solunum hızının saniyede yaklaşık bir nefeste tutulduğundan emin olmak için fareyi yakından gözlemleyin.
2. Fareyi tırnayırın ve ticari enjektörü ticari kılavuz kanüle yerleştirin (Şekil 3B).
   NOT: Ticari kılavuz kanül kan veya vücut sıvısıyla tıkanmışsa, cımbızla hafifçe tıkanıklığı açın.
3. Davranışsal testten önce farenin anesteziden 15 dakika boyunca bir kafeste iyileşmesine izin verin.
4. Temel hareket testi için, fareyi yeni bir kafese yerleştirin ve 35 dakika boyunca serbestçe keşfetmesine izin verin. İlk 5 dakikada 2.100 nL'lik bir hedef hacim için 7 nL/s'lik bir Dağıtım Hızı kullanarak SCFA'ları infüze edin (İnfüzyon moduna Yön'e basın ve RUN'a basın).
   NOT: Yeni kafesteki hareket, hayvan davranışı video izleme yazılımı kullanılarak analiz edilebilir.
5. Fareyi uyuşturun (adım 7.1'i tekrarlayın) ve ticari enjektörü ticari kılavuz kanülden çıkarın.
   NOT: Önceki enjeksiyonu yıkamak için uygun süre verildikten sonra fareye tekrar tekrar farklı kontroller/metabolitler enjekte edilebilir. Kanül farenin kafasına sabitlendiği sürece, fare farklı metabolitlerle tekrar tekrar test edilebilir.

8. Mikroenjeksiyon sisteminin restorasyonu

:

1. Polietilen tüpü mikrolitre şırıngadan sökün.
2. Polietilen tüpteki damıtılmış suyu atmak için insülin şırıngasını kullanarak tüpe hava enjekte edin. Mikrolitre şırıngayı boşaltın.
3. Şırınga Durdurma Şekil Tanımı ekranını açmak için Yapılandırma ekranında Pos'u Sıfırla'ya basın (Şekil 3C).
4. Mikroenjeksiyon pompasını tamamen geri çekilmiş konuma sıfırlamak için bir bip sesi gelene kadar Geri Çek'e basın (Şekil 3C).
5. Komut ekranına dönün ve bu ekranda bir **END REACH** işareti varsa mikroenjeksiyon kontrol cihazını kapatın (Şekil 3C).

Sonuçlar

Şekil 1: Ticari kılavuz kanülün farelere implantasyonu. (A) Ticari bir kılavuz kanül, manken ve enjektörün temsili görüntüsü. (B) Dental akrilik ile fiksasyon yoluyla farelerin beynine implante edilen ticari bir kılavuz kanül ve mankenin tem...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Material
Advil Liqui-Gels Çözündürülmüş Ibuprofen A2:D41	Pfizer	n/a
Şişe Üstü Vakum Filtresi, 500 mL, 0.22 μm, PES, Steril	NEST	121921LA01
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C1016	ACSF: 0,14 g/L
Klorheksidin ovma %2	Phoenix	NDC 57319-611-09
Klorheksidin çözeltisi	Phoenix	NDC 57319-599-09
Ticari kukla	RWD Yaşam Bilimleri	62004	Single_OD 0,20 mm/ M3,5/G = 0,5 mm
Ticari kılavuz kanül	RWD Life Science	62104	Single_OD 0,41 mm-27G/ M3,5/C = 2,5 mm
Ticari enjektör	RWD Life Science	62204	Single_OD 0,21 mm-33G/ M3,5/C ile montaj ilişkileri = 3,5 mm/G = 0,5 mm
D-(+)-Glikoz	Sigma-Aldrich	G8270	ACSF: 0,61 g/L
Diş akrilik	HİJYENİK	n/a
Sabitleme vidaları	RWD Yaşam Bilimleri	62521
At serumu	ThermoFisher Scientific	16050130
İnsülin şırıngaları	BBraun	XG-LBB-9151133S-1BX	1 mL
İzofluran	Panion ve BF biyoteknoloji	DG-4900-250D
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	ACSF: 0,19 g/L
Ketoprofen	İsviçre İlaç	n/a
Lidokain	AstraZeneca	yok
Düşük erime noktalı agaroz	Invitrogen	16520
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M8266	ACSF: 0,19 g/L
Mikroskop slaytları	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001E
Mineral yağ lambası, beyaz NF	Macron İnce Kimyasallar	MA-6358-04
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	ACSF: 7,46 g/L
NaH₂PO₄	Sigma-Aldrich	S8282	ACSF: 0,18 g/L
NaHCO₃	Sigma-Aldrich	S5761	ACSF: 1,76 g/L
n-bütil siyanoakrilat yapıştırıcı (doku yapıştırıcı tutkal)	3M	1469SB	3M Vetbond
Nöral izleyici	Santa Cruz	SC-358883	FluoroGold
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	P6148
Polietilen tüp	RWD Life Science	62329	OD 1.50, ID 0.50 mm ve OD 1.09, ID 0.38 mm
Puralube Vet (göz) Merhem	Dechra	12920060
Sodyum asetat	Sigma-Aldrich	S2889	SCFA'lar: 13.5 mM
Sodyum azid	Sigma-Aldrich	S2002
Sodyum bütirat	Sigma-Aldrich	B5887	SCFA'lar: 8 mM
Sodyum propiyonat	Sigma-Aldrich	P1880	SCFA'lar: 5.18 mM
Paslanmaz kılavuz kanül	Chun Ta paslanmaz çelik işletme CO., LTD.	yok	OD 0,63 mm; Yerel satıcı
Paslanmaz enjektör	Chun Ta paslanmaz çelik kurumsal CO., LTD.	yok	Dış çap 0,3 mm; kukla enjektörden yapılmıştır; yerel satıcı
Süper yapıştırıcı	Krazy Tutkal	KG94548R
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Ekipman
Kanül tutucu	RWD Yaşam Bilimleri	B485-68217
Tavan kamerası	FOSCAM	R2
Dijital stereotaksik aletler	Çalmak	51730D
Diseksiyon mikroskobu	INNOVIEW	SEM-HT / TW
Cam Boncuk Sterilizatörü	RWD Yaşam Bilimleri	RS1501
Isıtma yastığı	Çalmak	53800M
Mikro Diseksiyon Forseps	ROBOZ	RS-5136	tırtıklı, hafif eğri; Ekstra hassas; 0,5 mm uç genişliği; 4" Uzunluk
Mikro Diseksiyon Makası	ROBOZ	RS-5918	4.5" Açılı Keskin
Mikroenjeksiyon kontrol cihazı	World Precision Instruments (WPI)	MICRO2T	SMARTouch Kontrol Cihazı
Mikroenjeksiyon şırınga pompası	World Precision Instruments (WPI)	UMP3T-1	UltraMicroPump3 Mikrolitre
şırınga	Hamilton	80014	10 μL
Çift Fiber Adımlı Fiber Optik Soğuk Işık		LGY-150	Yerel satıcı
Evcil hayvan düzeltici	WAHL	09962-2018
Yazılım
Hayvan davranışı video izleme yazılımı	Noldus	EthoVision	Sürüm: 15.0.1416