Omurilik Yaralanması Sonrası Aksonal Rejenerasyon için Schwann Hücre Tohumlu Kanallar

Bu makalede

Özet

Kaynak: Lee, Y., et.al. Boşluk boyunca akson rejenerasyonunu teşvik etmek için kesilen sıçan omurilik kütüklerini köprülemek için PVDF-TrFE kanalları içindeki Schwann hücrelerinin transplantasyonu. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, kesilen bir sıçan omuriliğinde akson rejenerasyonunu teşvik etmek için Schwann hücreleri ile tohumlanmış bir piezoelektrik polimer kanalının kullanımını göstermektedir. Kanal, yapısal rehberlik sağlarken, biyoelektrik özellikleri nörit büyümesini uyarır. Kanal içindeki Schwann hücreleri, rostral ve kaudal kütükler arasındaki aksonal köprülemeyi destekleyen nörotrofik faktörler salgılar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

Ekartörü T7 ila T9 arasına yerleştirin. Tüm laminalar çıkarıldıktan sonra, özellikle T8'de enine işlemler arasındaki boşlukların görünür olduğundan emin olun. Ayrıca, dışa doğru çıkıntı yapan kemik parçaları olmadığından emin olmak için T7 ile T9 arasındaki her iki taraftaki uzunluk boyunca kemikleri inceleyin.
NOT: T8'deki bu boşluk, tam transeksiyonun gerçekleştirilmesi için önemlidir. Daha kolay kanal yerleştirilmesi için uzunluk boyunca omurlar çıkarılmalıdır.
Açılı yaylı makas kullanarak sırt ve ventral kökleri T8'in üstünde ve altında kesin. Omuriliğe tuzlu su ekleyin ve kanın pıhtılaşmasını bekleyin.
NOT: Bu adım, kanalın uygun şekilde yerleştirilmesi için önemlidir.
Açılı yaylı makası omuriliğin üzerine, T8'deki enine süreçler arasındaki boşluklara yerleştirin ve omuriliği tamamen kesmek için bir kesi yapın. Elde edilen 2-2,5 mm'lik boşluğa küçük bir parça sıkıştırılmış köpük yerleştirin ve alana hemen tuzlu su ekleyin.

2. Kanal ekleme

Kopan kordon kütüklerinin hemostaza ulaşmasını beklerken, 1x PBS'den bir kanal çıkarın. Absorpsiyon üçgenlerini ince uzun parçalar halinde kesin ve fazla PBS'yi çıkarmak için kanala yerleştirin. Önceden kesilmiş pencerelerin açık olup olmadığını kontrol edin.
İnce uzun emilim üçgenleri kullanarak salin ve kanı çıkarın. İyi bir ayrım sağlamak için bir mikrospatula kullanarak omuriliğin iki kütüğünü kaldırın. Rostral kütüğü mikrospatula ile nazikçe kaldırın ve kanalı, pencereler kendine bakacak şekilde kütüğün üzerinden kaydırın. Tüm kütüğün yerleştirildiğinden ve kanalda fazla kanama olmadığından emin olun.
Kuyruk kütüğünü yavaşça kaldırın ve kanalın diğer ucunu kütüğün üzerinden kaydırın. Kütüğün tamamının yerleştirildiğinden ve pencerelerin sırt yüzeyinde olduğundan emin olun (Şekil 1A).

3. Schwann Hücresi (SC) / Enjekte Edilebilir Matriks Hazırlama ve Enjeksiyon

Kopan kordonun hemostaza ulaşmasını beklerken, GFP-SC peletinin üzerindeki ortamı çıkarın. GFP-SC'leri 10 μl soğuk DMEM/F12'de yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonuna 10 μl soğuk enjekte edilebilir jel ekleyin ve tekrarlanan pipetleme ile iyice karıştırın. Kanal yerleştirme işlemi tamamlanana kadar GFP-SC/DMEM/F12/enjekte edilebilir matris karışımını buz üzerinde tutun.
Sırt yüzeyindeki pencerelerin açık olduğundan emin olduktan sonra (Şekil 1A), 20 μl GFP-SC/DMEM/F12/enjekte edilebilir matris karışımını, bir western blot yükleme ucu ve bir mikropipet kullanarak önceden kesilmiş pencerelerden birinden kanala enjekte edin. SC / DMEM / F12 / enjekte edilebilir matris karışımının kanalı aşırı doldurması gerekiyorsa, fazlalığı absorpsiyon üçgenleri ile çıkarın. Enjeksiyondan sonra pencereleri kapatın; dikiş atılmasına gerek yoktur (Şekil 1B).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1: SC/DMEM/F12/matris enjeksiyonundan sonra pencere kapanıyor. Kanallar rostral ve kaudal kütükler (A) arasına yerleştirildikten sonra her bir kanat geriye katlanarak açılır. Enjeksiyondan sonra pencereler kapatılır (