Fare Beyin Dokusundaki Miyelinli Nöronları Görselleştirmek için Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisi

Özet

Kaynak: McCullagh, EA, et al. Beyin Dilimlerinde Miyelinasyonu Görüntülemek için Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisi (CARS) Uygulaması. J. Vis. Uzm. (2022)

Video, kemirgen beyin dokusundaki nöronal mimariyi görselleştirmek için floresan ve Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisi (CARS) görüntülemeyi göstermektedir. Nissl boyama, ribozomal RNA'ya bağlanarak hücre gövdelerini etiketlerken, CARS görüntüleme, lazerle indüklenen sinyaller yoluyla lipit açısından zengin miyelini hedefler. Floresan ve CARS görüntülerinin üst üste bindirilmesi, hücre gövdelerinin ve miyelinli aksonların ayrıntılı bir görünümünü sağlar.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Boyama

1. Hücre gövdelerini görselleştirmek için Nissl için lekesiz yüzen bölümler (1:100), antikor ortamında (AB ortamı: 0.1 M fosfat tamponu (PB: 50 mM KH2PO4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, %1 sığır serum albümini (BSA)) standart bir laboratuvar çalkalayıcıda oda sıcaklığında 30 dakika boyunca.
   1. Alüminyum folyo ve/veya bir kapak kullanarak bölümleri ışıktan koruyun. 550 nm veya daha düşük dalga boyları CARS görüntüleme ile uyumludur (Şekil 1).
      NOT: Triton-X veya diğer reaktiflerin lipitlerin CARS görüntülemesi üzerinde bir etkisi olmasını beklemesek de, spesifik antikor ortamı ile ek kontroller garanti edilebilir.
2. DURAKLAMA NOKTASI: Serbest yüzen bölümleri (ışıktan korunurken) görüntülemeye kadar fosfat tamponlu tuzlu suda (PBS) saklayın. Bölümlere ayrıldıktan sonra, 2 hafta içinde beyin bölümlerini görüntüleyin.

2. Görüntüleme

NOTU: CARS lazer kurulumu, 80 MHz saat sağlayan bir fiber lazer ve CARS sinyalini toplamak için gerekli olan 1031 nm'de sabitlenmiş Stokes ışını ile 770-990 nm ayarlanabilir aralığa sahip bir OPO (Optik Parametrik Osilatör) lazer içerir. Her iki ışın için bir açıklık vardır.

1. Numuneleri mikroskoba getirmeden önce, CARS lazerini açın ve en az 1 saat ısıtın, CARS lazerini hizalayın ve ileri CARS görüntüleme için kondansatör optiklerini ve mikroskobun diyaframını Koehler'e hizalayın.NOT: Bu adım, CARS mikroskobunun düzgün çalışması için kritik öneme sahiptir.
   1. İki lazer ışınının (pompa ve stoklar) uzamsal hizalaması için, CARS lazer GUI (grafik kullanıcı arayüzü) aracılığıyla iki dahili PSD'ye (konuma duyarlı dedektörler) erişin.
   2. Farklı dalga boyları nedeniyle farklı dağılımlara sahip iki lazerin (pompa ve stoklar) darbelerinin üst üste binmesine yardımcı olabilecek CARS lazer GUI'deki gecikme işlevini kullanarak zamansal hizalama elde edin. Bu nedenle, pompa ve stokes kirişlerinin hem zamansal hem de uzamsal örtüşmesi, GUI aracılığıyla kullanıcı girişi ile yapılır.
   3. Uzamsal olarak üst üste binen iki lazeri mikroskobun tarama kafası aynalarına ortalamak için harici periskopu (kurulumun son iki aynası) ayarlayın.
   4. En iyi ileri CARS taranmamış algılama için, kondansatörün Koehler-ed olduğundan emin olun (yani, kondansatörün ortalandığı ve düzgün aydınlatma elde etmek için diyaframa odaklandığı anlamına gelir)
2. İmmünofloresan konfokal görüntüleme ve CARS görüntüleme için, floresan görüntüleme için görünür lazerlerle donatılmış bir konfokal mikroskop dahil ederek CARS lazerini hem ileri hem de epi CARS taranmamış dedektörler (NDD'ler) ile takın (Şekil 2).
3. Bölümleri, lamel (ters mikroskopi için), dokunun kurumasını önlemek için PBS ve dokuyu lamelin yakınında tutmak için bir cam ağırlık içeren bir kültür kabına yerleştirin.
4. Yamuk cismin (MNTB) medial çekirdeği gibi beyin alanlarını görüntülemek için epi yönünde ve ileri yönde 0,55 NA kondansatör aracılığıyla CARS sinyalinin toplanmasına yarayan 60X, 1,2 sayısal açıklık (NA) kızılötesi düzeltmeli su objektifi ile z-yığınları veya tekli görüntüler çekin.
   1. CARS lazer GUI'yi kullanarak CARS görüntülerini yaklaşık 600 mW pompa/prob ve 300 mW Stokes'ta çekin. Bu lazer gücü değerleri sistem tarafından dahili olarak ölçülür. Her iki lazerin de numune yerindeki gücü 25 mW'tan azdır ve doku numunesi için güvenlidir.
   2. Pompa ve Stokes kirişlerini mekansal ve zamansal olarak üst üste getirin. OPO'yu 797,2 nm'ye ayarlayın. Bu, 650 nm'lik bir CARS dalga boyu verir. Daha yüksek enerji seviyesi nedeniyle, ortaya çıkan temel duruma dönüş, uyarıma karşı anti-Stokes'tur (maviye kaymıştır).
   3. Bant geçiren filtreler (640-680 nm) kullanarak epi veya ileri taranmamış dedektörlerde CARS sinyalini yakalayın ve ardından immünofloresan etiketinin sıralı tespitini yapın (bu örnekte floresan olarak etiketlenmiş Nissl). not: Nissl nöronal soma belirteci, CARS 640-680 nm bant geçiren filtreye yakalanmaz, bu da aşağıda sunulan görüntülerde floresan ve CARS görüntülemenin kombinasyonuna izin verir.
   4. CARS ve floresan PMT'leri paylaşmaz. Beyin bölgesindeki miyelinasyonu seçici olarak görüntülemek için optimal lipid sinyali için bu ayarları kullanın. Dikkat: Kullanıcıyı lazer ışınından koruyun Görüntüleri
5. , daha fazla niceleme için bir görüntü analiz programına aktarılabilen .oib dosyaları olarak kaydedin (Şekil 3).

Sonuçlar

Şekil 1: CARS görüntüleme, immünofloresan görüntüleme ile birleştirilebilir. Grafikler, CARS görüntülemenin 660/640 nm kırmızı sinyal spektrumunda gerçekleştiğini göstermektedir. Bu dalga boyu yeşil, mavi veya UV aralığından yeterince uzakta...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Boyama:
AB Ortam:			1n 1.000 mL Millipore H2O
Fosfat tamponlu (PB):
Potasyum Fosfat Monobase	Sigma	P5655
Sodyum Fosohate Dibasic	Sigma	S7907
BSA (Sığır serum albümini)	Sigma yaşam bilimleri	A2153-100g
Sodyum Klorür	Fisher Kimyasal	s271-1
Triton X-100	Sigma - Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS:
APE picoemerald lazer	Angewandte Physik & Elektronik GmbH
bant geçiren filtre (420-520 nm)	Chroma Technology	HQ470 / 100m-2P
bant geçiren filtre (500-530 nm)	Chroma Technology	HQ515 / 30m-2P
bant geçişi filtreler (640-680 nm)	Chroma Teknolojisi	HQ660/40m-2P
Konfokal mikroskop	Olympus	FV1000
Kesim Transfer pipeti	Fisher	13-711-7M
dikroik uzun geçiren 565 nm	Chroma Teknolojisi	565dcxr
dikroik uzun geçiren 585 nm	Chroma Teknolojisi	585dcxr
dikroik kısa geçiren 750 nm	Chroma Technology	T750spxrxt
cam alt kültür kabı	MatTek	P35G-0-10-C
cam ağırlığı (10 mm x 10 mm boro çubuk)	Allen Scientific Glass Inc
multifoton kısa geçiren emisyon filtresi 680 nm	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS