Larva Zebra Balıklarının Lateral Çizgi Tüy Hücrelerinde Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Lukasz, D., et al. Larva Zebra Balıklarında Lateral Çizgi Tüy Hücrelerinin İn Vivo Kalsiyum Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, felçli bir transgenik zebra balığı larvasının lateral çizgi saç hücrelerindeki kalsiyum akışının konfokal mikroskop kullanılarak canlı olarak görüntülenmesini göstermektedir. Saç demetlerinin sıvı darbeleri yoluyla mekanik olarak uyarılması, floresan göstergeleri kullanılarak gerçek zamanlı olarak görselleştirilen mekanotransdüksiyon kanalları ve voltaj kapılı kanallar yoluyla kalsiyum girişini indükler. Yöntem, nöromast tüy hücrelerinde apikal ve bazal kalsiyum dinamiklerini vurgulayarak su hareketi tespitindeki rollerini aydınlatır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Larvaların Görüntüleme Odasına Sabitlenmesi ve Hareketsiz Hale Getirilmesi
   1. Bir Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) larvasını yaklaşık 1 mL embriyo tamponu (E3) tamponunda %0.04 MS-222 larva hareketsiz hale gelene veya dokunmaya tepkisiz hale gelene kadar görüntüleme odasının silikon kapsülleyici yüzeyinde 1-2 dakika boyunca yıkayın.
      1. Stereomikroskop altında, larvaları perfüzyon odasının merkezine, silikon kapsülleyiciye karşı yan yatacak şekilde yerleştirin.
         NOT: Tutarlılık için larvaları her zaman aynı tarafa monte edin (örn. sağ taraf aşağı, sol taraf yukarı) (Şekil 2B1).
   2. İnce forseps kullanarak, 0.035 mm'lik bir kafa pimini larva ve hazneye dik olarak aşağı getirin. Kafa pimini göz ile otik vezikül arasına ve kapsülleyiciye yerleştirin (Şekil 1B1 ve 1B2). Sabitleme sırasında larvaları dorsal veya ventral tarafı boyunca stabilize etmek için ikinci bir forseps seti kullanın. Pimin yatay kısmının larva ile temas ettiğinden ve kapsülleyiciye tamamen bastırmadığından emin olun. Sonraki kalp enjeksiyonu ve saç hücresi görüntülemesine müdahale etmemek için pimi ventral olarak (Şekil 1B1) veya balığın ön kısmına doğru hafifçe işaret ederek açın.
      1. Forseps kullanarak, 0,025 mm'lik bir kuyruk pimini kuyruğun ucuna mümkün olduğunca yakın notokorda sokun (Şekil 1B1).
         NOT: Larvaları germemeye dikkat edin. Larvaları düz bir şekilde sabitleyin. Gözler üst üste bindirilmelidir (Şekil 2B1). Bu, kalp enjeksiyonunun kolaylığı (Şekil 1B2-B2', adım 3), arzu edilen bir görüntüleme düzlemini kolaylaştırmak (Şekil 1B1-B2 '', adım 5) ve sıvı jeti uyaranının yoğunluğunu ölçmek (Şekil 3A3, adım 4) için çok önemlidir.
2. Larvaları Felç Etmek İçin Kalp Boşluğuna α-Bungarotoksin Enjeksiyonu

NOT: α-bungarotoksin ile çalışırken eldiven giyin.

1. Kalp enjeksiyon iğnesinin tıkanmasını önlemek için kullanmadan önce α-bungarotoksin alikotunu kısa bir süre santrifüjleyin.
   1. 3 μL α-bungarotoksin solüsyonunu bir jel yükleme pipet ucu kullanarak bir kalp enjeksiyon iğnesine geri doldurun. Çözeltiyi kabarcık olmadan uca eşit şekilde yükleyin.
   2. Kalp enjeksiyon iğnesini manuel bir mikromanipülatöre bağlı bir pipet tutucusuna yerleştirin. Bir stereomikroskop altında, iğneyi, sabitlenmiş ve anestezi uygulanmış larvaların AP eksenine dik olarak hizalanacak ve ~ 30 ° 'lik bir açıyla aşağı bakacak şekilde konumlandırın.
   3. Pipet tutucuyu basınç enjektörüne bağlayın. Aşağıdaki önerilen ayarları uygulayın: Penjeksiyon = 100 hPa, tenjeksiyon = 0,5 s ve Pcompensation = 5 hPa. İğne ucunun patentli olup olmadığını test etmek için çözeltiye bir bolus enjekte edin.
   4. İğnenin ucunu bırakmak için küçük bir kırmızı çözelti (fenol kırmızısından) olup olmadığına bakın. Kırmızı renk görülmezse, iğne ucunu bir iğnenin kenarına çok nazikçe kazıyın ve iğne patent alana kadar tekrar deneyin. Alternatif olarak, daha büyük bir uç açıklığı olan bir iğne çekin.
2. İğneyi, kalbin dışındaki cilde temas edene kadar kalbe doğru ilerletin (Şekil 1B2). İğneyi larvaya bastırın ve iğnenin larvaya göre doğru düzlemde konumlandırıldığından emin olmak için kalbin önündeki deride pigment hücresinin girintisini arayın (Şekil 1B2').
   1. İğneyi cildi delip kalp boşluğuna girene kadar ilerletin. İğneyi hafifçe geri çekin. Kalp boşluğuna bir bolus α-bungarotoksin enjekte edin. Kalp boşluğunun şişip şişmediğini veya boşluğa giren kırmızı boyayı arayın.
3. Kalan MS-222'yi çıkarmak için larvaları 1 mL nöronal tampon (NB) ile 3 kez nazikçe durulayın. Asla sıvının tamamını çıkarmayın. Larvaları perfüzyon odasında yaklaşık 1 mL NB'de tutun.
   NOT: Larva kalp atışının ve kan akışının sabitleme ve kalp enjeksiyonundan sonra ve tüm görüntüleme deneyi boyunca sağlam kaldığından emin olun.
4. Mikroskop ve Akışkan Jeti Kurulumunun Hazırlanması
   1. Malzeme Tablosunda açıklanan bileşenleri kullanarak dik bir konfokal mikroskop oluşturun: 488 nm lazer ve uygun filtrelere sahip bir konfokal mikroskop, görüntüleme ve stimülasyonu kontrol etmek ve koordine etmek için mikroskop yazılımı, 10x hava objektifi, 60x su objektifi, piezo-Z objektif tarayıcı (z-yığınları için), yüksek hızlı kamera, dairesel oda adaptör, motorlu tabla ve kademe ekleme adaptörü.
   2. 3 ana bileşenden oluşan sıvı jetini monte edin: bir vakum ve basınç pompası, yüksek hızlı basınç kelepçesi ve kafa aşaması (Malzeme Tablosunda da açıklanmıştır). Kafa aşamasından sıvı jetli pipete basınç veya vakum tahliyesinin zamanlamasını ve süresini kontrol etmek için yüksek hızlı basınç kelepçesini kullanın.
      1. Kafa aşamasının çıkışını kalın duvarlı silikon boru aracılığıyla sıvı jetli pipet tutucusuna bağlayın.
5. Larva ve Akışkan Jetinin Hizalanması

NOT: Her nöromast içinde 3 ilgi alanı vardır: (1) saç demetlerinin uçları (Şekil 3A3: uyaran yoğunluğunu ölçmek için kullanılan kinocilia); (2) saç demeti mekanotransdüksiyon (MET) düzlemi (Şekil 2B1-B1': MET kanalına bağlı kalsiyum sinyallerinin tespit edildiği apikal saç demetlerinin tabanı); ve (3) sinaptik düzlem (Şekil 2B2-B2': tüy hücresinin tabanında presinaptik kalsiyum sinyallerinin tespit edildiği yer). Bu düzlemler Şekil 2A'da özetlenmiştir.

1. 10 μL NB'yi bir jel yükleme ucu kullanarak düzgün kırılmış bir sıvı jet iğnesine geri doldurun. Çözeltiyi kabarcık olmadan uca eşit şekilde yükleyin. İğneyi motorlu mikromanipülatöre bağlı pipet tutucusuna yerleştirin.
2. Perfüzyon odasını mikroskop tablasındaki dairesel bir oda adaptörüne yerleştirin. not: Tutarlılık için, larvaları her zaman aynı yönde konumlandırın (örneğin, larvaları içeren oda, arka tarafı sıvı jetine doğru ve ventral tarafı deneyciye bakacak şekilde).
   1. Motorlu sahneyi, larva görüş alanının merkezinde olacak şekilde hareket ettirin. Dairesel oda adaptörünü, larvanın ön-arka (AP) ekseni sıvı jeti iğnesinin yörüngesi ile kabaca hizalanacak şekilde çevirin.
   2. İletilen ışığı ve diferansiyel girişim kontrastını (DIC) kullanarak larvayı odağa getirin ve 10x objektifin altında ortalayın. 10 kat hedefini yükseltin.
3. Motorlu mikromanipülatörü kullanarak, sıvı jeti iğnesini görüş alanının merkezine getirin, böylece iletilen ışıkla aydınlatılır ve NB çözeltisine zar zor dokunur.
   1. 10x hedefini düşürün. Konumunu doğrulamak için larvaya odaklanın. Sıvı jeti iğnesini bulmak için yukarı odaklanın. Sıvı jeti iğnesini, mikromanipülatör ile x ve y eksenlerinde, balığın sırt tarafına paralel bir konuma gelene kadar hareket
   ettirin.
   2. Larvaya geri odaklanın. İğneyi z ekseninde aşağı indirin. İğneyi balığın sırt tarafı boyunca ve vücuttan ~1 mm uzağa yerleştirin (Şekil 3A1).
   3. Sıvı jeti iğnesinin larvanın AP orta hattı boyunca hizalandığından emin olmak için dairesel hazne adaptörünü (gerekirse) dikkatlice hareket ettirin (Şekil 3A1).
   4. İlgilenilen nöromastı görüş alanının merkezine yerleştirmek için motorlu sahneyi hareket ettirin. Sıvı jeti iğne ucunu balığın sırt tarafı boyunca tutun. Sıvı jeti iğnesinin ucunu larvaya veya hazne yüzeyine dokunmayın.
4. 60x su hedefine geçin. Hedefin NB çözümüne daldırıldığından emin olun. İletilen ışığı ve DIC optiklerini kullanarak bir nöromastın yerini belirlemek için ince odağı kullanın.
   NOT: Bu kurulum, birincil posterior lateral çizgi boyunca nöromastları uyarmak için tasarlanmıştır. Bu nöromastlardaki tüy hücreleri, anterior veya posterior yönlendirilmiş sıvı akışına yanıt verir.
   1. Sıvı jeti iğnesini mikromanipülatörle nöromastın dış kenarından 100 μm uzakta olacak şekilde konumlandırın (Şekil 3A2).
      NOT: Yan açılı görünümler yerine yukarıdan aşağıya net görünümler sunan nöromastları seçin (Şekil 2C1-C2) (Şekil 2C1-C2)). Net bir yukarıdan aşağıya görünüm, tüm apikal saç demetlerinin tek bir optik düzlemde aynı anda görüntülenmesine veya sinaptik alanların daha az optik düzlemde görüntülenmesine olanak tanır (Şekil 3A3).
   2. Apikal saç demetlerinin (kinocilia) uçlarına odaklanın (Şekil 1A, Şekil 3A2 ve 3A3). Sıvı jeti iğnesinin alt kısmı bu düzlemde odakta olmalıdır.
5. Görüntüleme yazılımından girdi almak için yüksek hızlı basınç kelepçesini manuel moddan harici moda ayarlayın.
   1. "Sıfır" düğmesine basarak yüksek hızlı basınç kelepçesini sıfırlayın. Dinlenme basıncını biraz pozitif (~2 mmHg) ayarlamak için ayar noktası düğmesini kullanın. Kafa aşamasına bağlı inç kare başına pound (PSI) manometresi kullanarak yüksek hızlı basınç kelepçesinin dinlenme çıkışını onaylayın.
      NOT: Sıvının zamanla sıvı jeti iğnesine kademeli olarak alınmasını önlemek için dinlenme sırasında hafif pozitif bir basınç ayarlayın. Sıvı, sıvı jetine bağlı boruya girer ve kafa aşamasına ulaşırsa, ekipmana zarar verebilir.
   2. Saç demetlerini uyarmak için gereken basıncı belirleyin. Bir test uyaranı uygulamak için 0.125–0.25 ms boyunca 6.25 ve 12.5 V giriş (200 ve 500 mmHg) kullanın (Şekil 3A3-A3'').
      NOT: Yüksek hızlı basınç kelepçesi, bir voltaj girişini (yüksek hızlı basınç kelepçesi komut bağlantı noktasındaki Bayonet Neill–Concelman (BNC) bağlantı noktasına bağlanan yazılımdan veya diğer cihazlardan) kafa aşamasından boşaltılan basınca dönüştürür, ve son olarak, sıvı jeti iğnesi (1.0 V = 50 mmHg, -1.0 V = -50 mmHg iken). Bu konfigürasyonda (bkz. adım 4.2) pozitif basınç (itme) saç demetlerini öne doğru saptırır ve negatif basınç (çekme) saç demetlerini arkaya doğru saptırır.
   3. Bir ölçek çubuğu ile birlikte iletilen ışık ve DIC optiklerini kullanarak, saç demetlerinin uçlarının, kinosilinin 6.25 ve 12.5 mmHg uyaranlarının sapma mesafesini ölçün (Şekil 2A ve Şekil 3A3-3 ''). Demetleri (1 yapışkan birim olarak) yaklaşık 5 μm'lik bir mesafede hareket ettiren bir basınç seçin (Şekil 3A3 ''). Kinosilia uçlarının tüm zaman boyunca odakta kaldığından emin olun.
   4. Kinosilia 5 μm uçlarını saptıran bir mesafe ve basınç bulmak için sıvı jeti ± larvanın AP ekseni boyunca 25 μm hareket ettirin.
      NOT: Döllenmeden 3-7 gün sonra (dpf) larvalarda GCaMP6'ların kullanılması, 5 μm'lik bir sapma, doymuş GCaMP6s kalsiyum sinyallerine yakın olmalı ve apikal tüy demeti yapılarına zarar vermemelidir (Şekil 3A3 ''). Doymamış uyaranları iletmek için daha küçük yer değiştirme mesafeleri kullanılabilir (Şekil 3A3'). 10 μm > yer değiştirme mesafelerinin tahmin edilmesi zordur (Şekil 3A3''') ve zamanla zarar verici olabilir. Sinyal doygunluğu, nöromastın yaşına (ve kinosiliyal yüksekliğe) ve kullanılan göstergeye bağlıdır. Görüntüleme sırasında sıvı jeti iğnesinin her yöndeki (basınç/itme ve vakum/çekme) açıklığını periyodik olarak kontrol edin. Akışkan jeti iğneleri kolayca tıkanır ve vakum açıklığını kaybeder, ancak artık basınç açıklığını korurlar. Sıvı jeti açıklığını kontrol etmek için DIC optiği ve her yönde kısa bir test uyarıcısı kullanın.
   5. Numuneyi ilgilenilen düzleme odaklayın (örneğin, apikal saç demetlerinin tabanı veya sinaptik düzlemdeki saç hücresinin tabanı; Şekil 2B1-B2').
6. Görüntüleme Edinme Prosedürü: Tek Düzlemli Edinme

NOT: Bu protokolde özetlenen tüm görüntülemeler oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilir.

1. Görüntüleme yazılımını, 10 Hz'lik bir kare hızı elde etmek için her 100 ms'de bir yakalama ile akış veya sürekli 80 kare alımı elde edecek şekilde ayarlayın.
2. Sinyal algılamayı optimize etmek için kazancı, diyaframı ve lazer gücünü ayarlayın, ancak doygunluk, foto ağartma ve gürültüden kaçının. Bir Opterra/SFC için örnek ayarlar aşağıdaki gibidir: 488 nm lazer gücü: 50 (saç demeti MET düzlemi), 75 (sinaptik düzlem); 35 μm yarık; kazanç = 2.7; EM kazancı = 3900.
   NOT: Sinyaller çok zayıf veya gürültülüyse veya aşırı fotoağartma varsa 2 X gruplama uygulayın. 2 X gruplama, uzamsal çözünürlük pahasına sinyal algılamayı geliştirecektir.
3. 30. kareden sonra 80 kare (8 sn) alımı sırasında iletilecek bir uyaran seçin, 3 s.NOT: Bazı örnek uyaranlar aşağıdaki gibidir: 200 ms (+ veya - 0.25 V) ila 2 s (+ veya - 0.25 V) adım her bir saç hücresinin yönlü hassasiyetini belirlemek için ön veya arka yönde; 2 s, Tüm saç hücrelerini aynı anda uyarmak için 5 Hz kare dalga (200 ms için 0.25 V, 200 ms için -0.25 V, 5 kez tekrarlanır). Pozitif bir basınç (ön uyaran) saç hücrelerinin yarısını aktive edecektir. Negatif bir basınç (posterior uyaran) saç hücrelerinin diğer yarısını aktive edecektir. Uyaran yazılımının veya cihazının, uyaran bittikten sonra basınç kelepçesini 0 V'a geri döndürdüğünden emin olun.
4. Mekanosensitif kalsiyum tepkilerini ölçün. Apikal saç demetlerinin tabanına odaklanın (Şekil 2A ve 2B1-B1') ve görüntü alımına başlayın.
   NOT: Nöromast yukarıdan aşağıya net bir şekilde görülüyorsa (Şekil 2B1-B1'), tüm apikal saç demetleri tek bir düzlemde aynı anda görüntülenebilir.
5. Presinaptik kalsiyum tepkilerini ölçün. Saç hücrelerinin tabanına odaklanın (Şekil 2A ve 2B2-B2') ve görüntü alımına başlayın.
   NOT: Nöromast yukarıdan aşağıya doğru net bir şekilde görülüyorsa (Şekil 2B2-B2'), tüm saç hücrelerinin presinaptik görüntüleme düzlemleri 2 μm aralıklarla ayarlanmış 2-3 düzlemde elde edilebilir. Tg[myo6b:antrikot-kiraz] transgenik balık, presinaptik şeritleri ve kalsiyum giriş bölgelerini tanımlamak ve bulmak için kullanılabilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Görüntüleme odası, zebra balığı montajı ve kalp enjeksiyon prosedürleri ve iğneler. (A) Gösterilen, silikon kapsülleyicinin üzerinde merkeze sabitlenmiş bir larva (kesikli bir dikdörtgenle özetlenen) bulunan bir görüntüleme odasıdır....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
α-Bungarotoksin	Ar-Ge Sistemleri	2133	Görüntülemeden önce larvaları felç etmek için
Görüntüleme odası	Siskiyou	PC-R	Görüntüleme için larvaları monte etme platformu
No. 1.5 Lameller kare, 22*22 mm	VWR	48366-227	Görüntüleme odasını kapatmak için
Yüksek vakumlu silikon gres	Fischer Scientific	14-635-5D	Lamelin görüntüleme odasına yapıştırılması için
Silikon kapsülleyici şeffaf 0,5 g kit	Ellsworth Yapıştırıcılar	Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KİTİ 0,5KG	Balıkları sabitlemek için bir yüzey oluşturmak üzere görüntüleme odasını doldurmak için
Stereomikroskop	Carl Zeiss Mikroskobu	İletilen ışık aydınlatmalı Stemi 2000	Pim yapmak için tel, forseps ve makası aydınlatmak için
İnce forseps	Güzel Bilim Aletleri	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Ürün No. 11295-10	Pim yapmak için
İnce makas	Cole-Palmer	5.5", EW-10818-00	Pim yapmak için tunsgten telini kesmek için
Tungsten tel, 0,035 mm	Goodfellow	W005131	Larvaları hareketsiz hale getirmek için kafa pimleri için
Tungsten tel, 0,025 mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	Larvaları hareketsiz hale getirmek için kuyruk pimleri için
Filamentsiz borosilikat cam kılcal damarlar	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	Saç hücrelerini uyarmak için sıvı jetli iğnelere çekilecek cam
İnce forseps	Güzel Bilim Araçları	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Ürün No. 11295-10	Larvaları sabitlemek için
Jel yükleme ipuçları	Eppendorf	5242956003	Kalp enjeksiyon iğnelerini geri doldurmak için
Stereomikroskop	Carl Zeiss Mikroskopi	Stemi 2000 iletilen ışık aydınlatması	ile Sabitleme ve kalp enjeksiyonu sırasında larvaları aydınlatmak için
Cam kılcal / iğne tutucu	WPI	MPH315	Sıvı jeti iğnelerini tutmak için
Manuel mikromanipülatör	Narishige	M-152	α-bungarotoksin enjekte etmek için iğne tutucuyu tutmak ve konumlandırmak için
Manyetik stand	Narishige	GJ-1	α-bungarotoksin enjeksiyonu için manuel mikromanipülatörü tutmak için
Basınç enjektörü	Eppendorf	Femtojet 4x	α-bungarotoksin vermek için
Konfokal mikroskop	Bruker	Süpürülmüş alan/Opterra konfokal mikroskop	DIC optikli sabit, dik mikroskop ve uygun filtrelere sahip 488nm lazer
Mikroskop yazılımı	Bruker	Prairieview 5.3	Mikroskop, lazerler, sahne, piezo-z, kameralar ve sıvı jetini koordine etmek ve kontrol etmek
için 10x hava objektifi	Nikon	MRH00101	Larvaların ve sıvı jetinin konumlandırılması için düşük büyütme
60x su objektifi	Nikon	MRF07620	Yüksek NA (1.0) ve yeterli çalışma mesafesi (2.0 mm) ile suya daldırma objektifi)
Denetleyicili/sürücülü Piezo-Z objektif tarayıcı	Physik Intruments instruments/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	0.025um hassasiyetle yüksek hızlı z-stack alımı
EMCCD kamera	QImaging	Rolera EM-C2 EMCCD kamera	Saniyede 100 kareye kadar alabilen küçük piksel boyutuna sahip kamera
Dairesel hazne adaptörü	Siskiyou	PC-A	Mikroskop sahnesinde görüntüleme odasını tutmak ve döndürmek için
Motorlu Z-güverte aşaması	Önceki Bilimsel	ZDN12MP	Sıvı jeti iğneli numuneyi ve mikromanipülatörü bir arada tutabilen ve hareket ettirebilen mikroskop aşaması
Z-güverte aşaması ekleme adaptörü	NIH Makine atölyesi	özel	Dairesel hazne adaptörünü z-güverte aşamasına takmak için
Akışkan jeti aparatı	ALA bilimsel aletler	HSPC-1 PV-PUMP'lı Yüksek hızlı basınç Kelepçesi	Sıvı jeti uyaranını kontrol etmek ve iletmek için
Masterflex Peroksit ile kürlenmiş silikon boru (1 ft)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	Sıvı jeti iğne tutucusunu basınç pompasına bağlamak için
Motorlu mikromanipülatör	Sutter Instrument Company	MP-225	Sıvı için iğne tutucunun tutulması ve konumlandırılması için jet
Mikromanipülatör kontrolörü	Sutter Instrument Company	MPC-200	Sıvı jeti iğne manipülatörünü kontrol etmek için
Jel yükleme uçları	Eppendorf	5242956003	Sıvı jeti iğnelerini geri doldurmak için
Cam kılcal / iğne tutucu	WPI	MPH315	Sıvı jeti iğnelerini tutmak için
PSI manometresi	Sper Scientific	840081	Ölçüm için basınç kelepçesi çıkışı
Prism7	Graphpad	Prism7	GCaMP6 yoğunluk değişikliklerini çizmek için yazılım
FIJI	Schindelin, et., al.34<	a href='https://fiji.sc/'>https://fiji.sc/ Görüntüleri işlemek ve uzay-zamansal sinyal haritaları oluşturmak için yazılım Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29
		http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	GCaMP6 görüntü dizilerini FIJI
StackReg Eklentisi'ne	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	GCaMP6 görüntü dizilerini FIJI
Times Series Analyzer V3 Eklentisi'nde	Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA		GCaMP6 yoğunluk değişikliklerini ölçmek için birden fazla ROI oluşturmak için https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html Eklentisi

kaydetmek için eklenti kaydetmek için eklenti