$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Hazırlık
1. İki ince tırtıklı forseps kullanarak her kası yaklaşık 1 mm genişliğinde küçük lif demetleri halinde kızdırın.
NOT: Alay sırasında doku hasarını önlemek için kasları forsepslerle aşırı kuvvet kullanmadan çok nazikçe manipüle etmek çok önemlidir.
1. Tibialis anterior (TA) kasını boyutuna bağlı olarak 3 veya 4 demete ayırın.
2. Gastroknemius (GA) için, kasın medial ve lateral kısımlarını ayırın ve ardından her parçayı boyutlarına bağlı olarak 4-5 demete ayırın.
2. Immunostaining<
p style='margin-left:40px;'>1. Kas lifi geçirgenliğine devam edin: Kas demetlerini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 1 (v / h) Triton X-100 içeren 24 oyuklu plakalara aktarın ve bunları RT'de 1 saat veya 5 ° C'de 4 saat boyunca hafif çalkalama (50 rpm) altında tutun.
NOT: Ayrı immün boyamalara devam etmek ve antikor karışıklığı riskini en aza indirmek için kas demetlerini iki plaka arasında bölün. Bunları ikiden fazla kuyuya bölmeyin (1 kuyu / plaka); aksi takdirde, analiz edilen kastaki genel durumlarını temsil eden nöromüsküler kavşakların (NMJ'ler) sayısı (N) yetersiz olabilir.
2. Numuneleri RT'de PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayın ve hafif çalkalama altında (50 rpm) 4 saat boyunca PBS/Triton X-100 %1 içinde %4 sığır serum albümininden (BSA) oluşan bir bloke edici solüsyon ile inkübe edin.
NOT: Yıkama adımları sırasında aspirasyon pompası kullanmayın, bunun yerine solüsyonu 200 μL'lik bir pipet ve küçük boyutlu uçlarla manuel olarak aspire edin (referans Malzeme Tablosunda belirtilmiştir).
3. Numuneleri gece boyunca (O / N) hafif çalkalama altında (50 rpm) 4 ° C'de hafif çalkalama (50 rpm) altında, nörofilament M'ye (NF-M, 2H3, seyreltme 1/200) veya sinaptik vezikül glikoprotein 2'ye (SV2, seyreltme 1/200) karşı birincil monoklonal antikorlar içeren blokaj çözeltisi ile sırasıyla presinaptik akson terminallerini veya aktif bölgeleri etiketlemek için.
4. Ertesi gün, kas demetlerini ajitasyon altında (50 rpm) PBS'de 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
1. Konfokal görüntüleme için: Kas demetlerini, kırmızı yayan bir florofor (F594) (seyreltme 1/500) ile konjuge edilmiş ikincil anti-fare antikorları ve yeşil yayan bir florofor (α-BTX-F488) ile konjuge edilmiş α-bungarotoksin ile inkübe edin (seyreltme 1/1000) çalkalama altında RT'de 2 saat boyunca (50 rpm).
2. Uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) görüntüleme için: Kas demetlerini, yeşil yayan bir florofor (F488) (seyreltme 1/500) ile konjuge edilmiş ikincil anti-fare antikorları ve yüksek fotostabilite (α-BTX-F633) ile karakterize edilmiş α-bungarotoksin ile konjuge edilmiş -bungarotoksin ile inkübe edin (1/1000) çalkalama altında RT'de 2 saat boyunca RT'de (50 rpm).
NOT: Foto ağartmayı önlemek için inkübasyon sırasında numuneleri ışığa maruz bırakmayın.
5. Etiketli kas demetlerini 3x'i PBS ile 5 dakika boyunca çalkalama altında (50 rpm) yıkayın ve bunları bir montaj ortamı olan bir kızağa yerleştirin.
NOT: Sızdırmazlığa izin vermek için slayt başına en fazla 4 ila 5 kas demeti yerleştirin.
6. Üstüne #1.5 (veya #1.5H) cam lamel (0.17 mm kalınlık) ekleyin ve baskı uygulamak ve kasları düzleştirmek için slaytın her iki tarafına silindirik mıknatıslar yerleştirin.
7. Slaytları 4°C'de ışık O/N'den koruyun. Slaytları oje ile kalıcı olarak kapatın.
3. Görüntü alımı
1. Konfokal mikroskopla elde edilen görüntüler
NOT: Görüntüler, 63x büyüklüğünde yağa daldırma objektifi (HCX Plan Apo CS, 1.4 sayısal açıklık (NA)) kullanılarak ters çevrilmiş lazer taramalı konfokal mikroskop ile toplanmıştır.
1. Kör analiz için, analize dahil olmayan bir kişinin her slaydı belirli bir numara ile kodlamasına izin verin. Tüm numuneler için NMJ parametrelerinin nicelleştirilmesi tamamlanana kadar deney gruplarına karşı kör kalın.
2. >Mikroskop yazılımını machine.xlhw > Yapılandırma Modunda başlatın.
3. Slaytı mikroskop tablasına yerleştirin ve DAPI filtre seti ile DAPI geniş alan floresan aydınlatmasının altına bakarak numune içindeki gözlem düzlemini bulun.
4.Yeni Projeler > Projeyi Aç'a> tıklayın ve görüntü alımlarını depolamak için bir klasör oluşturun.
NOT: Klasör boyutunu sınırlamak ve bilgisayar belleği sorunlarını önlemek için her NMJ için yeni bir proje oluşturun.
5. Edinme parametrelerini yönetmek için, Edinme sekme penceresine tıklayın ve görüntülenmesi gereken uç plakada 488 nm'lik bir lazer kullanarak yeşil/F488 (α-BTX) floresan için kazanç ve ofset seviyelerini optimize etmek üzere konfokal iğne deliğini 1.0 Airy ünitesine ve lazer gücüne ayarlayın (Canlı mod AÇIK).
6. Ardından, F594 gözlemine uyarlanmış bir lazer kullanarak kırmızı/F594 (NF-M veya SV2) floresan alımını optimize edin. Bu çalışmada 552 nm lazer kullanıldı (Canlı mod AÇIK). Her lazer için boya emisyon spektrumunu aşağıdaki aralıklarla ayarlayın: 414 ila 483 nm arasında lazer 405 (DAPI), 506-531 nm arasında lazer 488 (F488-α-BTX) ve 622-650 nm arasında lazer 552 (NFM/ SV2).
7. Her deney grubundaki nöromüsküler kavşakların görüntü yığınlarını aynı ayarlarla toplayın: 400 Hz örnekleme hızında görüntü boyutu 1024 x 1024 piksel (73,7 x 73,7 μm), Çift Yönlü X AÇIK, Yakınlaştırma faktörü 2,5, Z-Wide modunda Z adım boyutu 0,5 μm.
NOT: Her NMJ için, dilim sayısı tüm birleşimi elde edecek şekilde ayarlanır. Yukarıda açıklanan edinim ayarları Nyquist-Shanon örnekleme teoremini yerine getirir. Bununla birlikte, kullanıcı, piksel boyutunun ve Z-adımının ideal Nyquist örnekleme hızını karşıladığından emin olmak için tüm yeni konfokal işletim yazılımlarında bulunan Formatı Optimize Et düğmesine tıklayabilir. Bu eylem, hacim ölçümlerinde doğruluk kaybına neden olacak fazla veya az örneklenmiş görüntüleri önleyecektir.
8. Orijinal dosyayı (.lif) veya Z yığını görüntülerini (.tif) slaytın kod adını, boyama türünü ve uç plaka numarasını içeren bir adla bir klasöre kaydedin.
NOT: F488 floresansının F594 kanalına karışmasını ve bunun tersini (taşma geçişi) önlemek için 488 nm ve 552 nm lazerleri (F488 ve F594) kullanarak taramaları sırayla (aynı anda değil) toplayın. Işın yolu, mikroskop yazılımındaki Boya Asistanı ile yapılandırılabilir.
9. Sonraki kodlanmış slayta geçin ve her NMJ için 3.1.3-3.1.8 adımlarını tekrarlayın.
10. Oturumun sonunda, 3D Görüntüleyicide Aç'a tıklayın ve 3D etiketlemeyi görselleştirmek için bir deney grubunun NMJ temsilcisini seçin.
NOT: Bu görünüm modu, alım parametrelerinin doğru olduğunu doğrulamaya yardımcı olur.
11. Mikroskop yazılımını kapatın, objektifleri lens mendilleriyle temizleyin ve ardından sistemi kapatın.
2. STED microscopy ile edinimler
NOT: Görüntüler, 100x yağa daldırma objektifi (HC PL APO CS2 1.4 NA) kullanılarak 775 nm'de Geçitli STED ile donatılmış ters çevrilmiş bir lazer taramalı konfokal mikroskopla toplanmıştır.
1. Kör analiz için, analize dahil olmayan bir kişinin her slaydı belirli bir numara ile kodlamasına izin verin. Tüm numuneler için NMJ parametrelerinin nicelleştirilmesi tamamlanana kadar deney gruplarına karşı kör kalın.
2. Mikroskop yazılımını machine.xlhw ve STED AÇIK > Yapılandırma Modunda başlatın.
3. Görüntü edinimlerini depolamak üzere bir klasör oluşturmak için Yeni Projeler > Projeyi Aç'a tıklayın.
>NOT: Klasör boyutunu sınırlamak ve bilgisayar belleği sorunlarını önlemek için her slayt için yeni bir klasör oluşturun.
4. Slaytı mikroskop tablasına yerleştirin ve numune içindeki gözlem düzlemini bulmak için 488 nm lazer kullanarak geniş alanlı floresan aydınlatması altında görüntüleyin.
5. 506-531 nm arasında spektral algılamalı 488 nm lazer kullanarak nörofilament M (NFM) veya SV2 boyama ile etiketlenmiş bir NMJ arayın.
6. Bir NMJ tanımlandığında, STED'i Etkinleştir'e tıklayın ve 640-750 nm arasında spektral algılamalı 635 nm lazer kullanarak birkaç bağlantı kıvrımı içeren bir bölgede görüntü almaya başlayın.
>NOT: Görüntü alımı sırasında doygunluk arama tablosuna dikkat edin ve aşırı pozlamayı önlemek için Hızlı LUT düğmesine tıklayın (gri değerler >255; 8 bit için).
7. Her deney grubunun görüntülerini aynı ayarlarla toplayın: 400 Hz örnekleme hızında görüntü boyutu 2048 x 2048 piksel (38,75 x 38,75 μm).
NOT: Tükenme lazeri (STED) gücü %65 olarak ayarlanmıştır.
8. Görüntüleri, slaytın kodunu içeren bir dosya adıyla kaydedin.
NOT: STED görüntüleme ile en iyi edinme ayarını elde etmek için Optimize Edilmiş XY Formatı: Formatı Ayarla'ya tıklamak mümkündür.
9. Sonraki kodlanmış slayta geçin ve 3.2.3-3.2.8 adımlarını yineleyin. Bu yordamı tüm slaytlar için yineleyin.
10. STED mikroskobu oturumunun sonunda, görüntü dosyalarını başka bir bilgisayara aktarın ve orijinal dosyaları (.lif) harici bir sürücüye veya sunucuya kaydedin.
11. Mikroskop yazılımını kapatın, objektifleri lens mendilleriyle temizleyin ve ardından sistemi kapatın.