Floresan Makroskobu Kullanılarak Bir Fare Beyninde Beyin Omurilik Sıvısı Taşınmasının İn Vivo Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Sweeney, A. M., et al. Floresan Makroskobu Kullanılarak Sağlam Fare Kafatasından Beyin Omurilik Sıvısı Taşınmasının İn Vivo Görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, floresan görüntüleme kullanarak bir fare beynindeki beyin omurilik sıvısı (BOS) akışını görselleştirme sürecini göstermektedir. Cisterna magna'ya (CM) bir floresan izleyici enjekte edilir ve BOS ile hareketinin subaraknoid ve perivasküler boşluklar boyunca izlenmesine izin verilir. Hızlandırılmış görüntüleme, izleyicinin yolculuğunu yakalar ve arteriyoller aracılığıyla beyin dokusuna dağılımını vurgular.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Cisterna magna kanülünün, kafa plakasının ve kafa tutucunun hazırlanması

1. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri ve kafa plakalarını sterilize edin.
   NOT: Floresan izleyiciler, bir cisterna magna kanülasyonu yoluyla doğrudan BOS'a verilir.
2. Kısaca, bir iğne sürücüsü kullanarak, 30G x 12.7 mm (1/2 inç) bir iğnenin ucunu 3/4'ü aşağı doğru kırın ve iğnenin kör ucunu polietilen 10 (PE10) borunun bir ucuna yerleştirin (yaklaşık 45 cm uzunluğunda). PE10 borusunun kenarından yalnızca eğimin dışarı çıktığından emin olun.
3. Başka bir 30G iğnenin eğimli ucunun 1/4'ünü kırın ve kalan iğnenin kör ucunu, plastik Luer kilidi hala takılı olacak şekilde PE10 borusunun diğer ucuna yerleştirin.
4. 100 μL'lik bir cam şırıngayı steril, yapay BOS ile doldurun (aCSF: 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH₂PO₄, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 10 mM glikoz ve 26 mM NaHCO₃).
5. Şırıngayı hattın sonuna takın ve eğimli iğnenin ucuna ulaşana kadar aCSF ile doldurun. Şırınganın hava ile değil aCSF ile doldurulması önemlidir, çünkü bir hava sütunu değişken infüzyon hacimlerine daha yatkındır.
6. Kronik deneyler için, satırı aCSF ile dolu bırakın ve Adım 1.7'yi atlayın.
7. Akut deneyler için, şırıngayı bir infüzyon pompasına yerleştirin ve karıştırmayı önleyecek şekilde yaklaşık 5 mm hava çekin. Daha sonra, deney için istenen toplam izleyici (ler) hacmini geri çekin (ölü alan kayıpları nedeniyle %20 ekstra önerilir).
   NOT: PE10 hortumu, izleyiciyi yüklerken hava kabarcığının cam şırınganın plastik manşetine girmemesi için yeterince uzun olmalıdır. Tipik bir deney için protokol, aCSF'de% 0.5 oranında seyreltilmiş Alexa Fluor 647 (BSA-647) ile konjuge edilmiş 10 μL sığır serum albümini kullanır.
8. Kafa plakasının kafa tutucuya oturduğundan ve kullanılan fare için doğru boyutta olduğundan emin olun. Bunu sağlamak için anatomik belirteçler şunlardır: pencerenin üst kenarı interoküler çizgi ile hizalanır ve arka kenarlık oksipital tepeye rostral düşer.
   NOT: Paslanmaz çelik kafa plakaları sterilize edilebilir ve yeniden kullanılabilir. Çoğu siyanoakrilat karışımı bir aseton çözeltisi ile çıkarılabilir.

2. Cerrahi prosedür

1. Fareyi tartın ve uyuşturun (örneğin ketamin / ksilazin; 100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg ksilazin; i.p.).
2. Fare artık ayak parmağını çimdiklemeye yanıt vermediğinde, boynu ve başı steril suyla nemlendirin ve makas kullanarak tıraş edin. Alan tıraş edildikten sonra, kalan tüyleri gidermek için alanı tekrar alkollü bir bezle silin.
   NOT: Kırpmadan önce kürkü nemlendirmek, kesiden sonra görüntüleme penceresindeki saç miktarını önemli ölçüde azaltır.
3. Fareyi, sıcaklık kontrollü bir pedin üzerine stereotaktik bir çerçeveye yerleştirin ve kurumaması için farenin gözlerine petrol oftalmik merhem sürün.
4. Açıkta kalan cildi klorheksidin bir çubukla temizleyin. 2 dakika sonra klorheksidini alkollü bir mendille çıkarın. Son olarak, kurumaya bırakılabilecek bir iyot çözeltisi uygulayın.
5. Kafatasının üstüne ve boynuna deri altı analjezi (% 0.25 Bupivakain HCl) enjekte edin.
6. Boynun oksipital tepeyi kaplayan kısmından başlayarak, üstteki deride orta hat kesimi yapın ve interorbital çizgiye doğru rostral olarak devam edin. Temporal kasın kafatasına girdiği sınıra yanal olarak kesin. Hem frontal hem de parietal kemikleri ortaya çıkarmak için fusiform insizyonun tüm derisini çıkarın.
   DİKKAT: Retroorbital sinüs gözlere kaudal olarak uzanır ve posterior fasiyal venin büyük dalları kulak kepçesine rostral olarak uzanır. Bu yapıları korumak için kesi yaparken dikkatli olun. Bu meydana gelirse, birkaç dakika steril bir pamuklu çubukla hemostazı koruyarak kanamayı durdurun ve devam edin.
7. Kafatasını steril tuzlu suyla yıkayın ve yüzeyi pamuklu çubuklarla temizleyin, böylece görüntü kalitesini etkileyeceğinden kalıntı ve saç içermez. Kafatası şeffaflığı en iyi şekilde periost ve üstteki fasyayı sağlam bırakarak korunur.
   NOT: Bu yapılar yanlışlıkla çıkarılırsa, kafatası zamanla kuruyabilir ve opak hale gelebilir. Akut deneylerde kafatası yansımasını azaltmak için aCSF ile yeniden nemlendirin veya parafin yağı ve gliserol karışımı kullanın.
8. Cisterna magna kanülünü yerleştirmeye devam edin.
9. CM kanülünü yerleştirdikten sonra, baş plakasının ventral tarafına kenarlığın etrafına siyanoakrilat yapıştırıcı ile diş çimentosu karışımı uygulayın ve kafa plakasının ön sınırı burun kemiğinin arka ucu ile aynı hizaya gelecek ve arka sınır interparietal kemiğin ön yönü ile aynı hizaya gelecek şekilde kafatasının üzerine yerleştirin, sagital sütürün (orta hat) pencereye göre ortalanmış ve düz olduğundan emin olun (Şekil 1B).
10. Birkaç damla tutkal hızlandırıcı kullanarak kafa plakasının konumunu sabitleyin. Kalan boşlukları çimento karışımıyla doldurun ve hızlandırıcı ile kürleyin.
    DİKKAT: Siyanoakrilatın farenin gözleriyle temas etmediğinden veya görüntüleme penceresini engellemediğinden emin olun.
11. Taşıma sırasında veya fare uyandığında ayrılmamalarını sağlamak için CM kanülünü kafa plakasına yapıştırın.
12. Akut deneyler için Adım 2.16'ya atlayın.
13. Kronik deneyler için, açıkta kalan kafatasına ince bir tabaka halinde kuruyan siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın ve görüntülemeyi engelleyeceğinden kabarcıklar oluşturmamaya dikkat edin. Yapıştırıcı kafatası için koruma sağlar ve görüntülemeye müdahale etmez. Yapıştırıcının açıkta kalan kafatasını kesi sınırındaki cilde kadar kapladığından emin olun.
14. ACSF dolgulu PE10 tüpünü CM'den 2-3 cm uzakta tutmak için bir kanama durdurucu kelepçesi kullanın ve çizgiyi yüksek sıcaklıkta bir koter ucu ile kesin. Ayrıldıktan sonra, kanülü kapatmak için erimiş PE10 borusunu düzleştirin.
    DİKKAT: Kanül kapatılana kadar kelepçeyi serbest bırakmadığınızdan emin olun ve BOS fistülünü önlemek için boruda sızıntı olmadığını onaylayın.
15. Carprofen uygulayın (3 gün boyunca her 24 saatte bir 5 mg / kg; intraperitoneal [i.p.] veya subkutan [s.c.]) ve fareyi sıcaklık kontrollü, tek yuvalı bir kafese geri koyun ve görüntülemeden önce en az 24 saat iyileşmesine izin verin. Sternal yaslığı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın. Sağlam kraniyal pencereler birkaç hafta boyunca stabil kalır. NOT: Kronik deney burada duraklatılabilir.
    DİKKAT: Bazı postoperatif komplikasyonlar şunlardır: sefalohematom/subgaleal hematomlar, BOS fistülleri ve enfeksiyon.
16. Akut deneyler için, kafatası sabit bir konumda olacak şekilde kafa plakasını kullanarak fareyi kafa tutucuya yerleştirin. Anestezi seviyesini kontrol ettiğinizden ve farenin altına bir ısıtma yastığı yerleştirdiğinizden emin olun. Fare artık makroskopa götürülmeye hazırdır.
    DİKKAT: Fareyi infüzyon pompasıyla birlikte bir araba üzerinde dikkatlice taşıyın. CM kanülasyonu yerinden çıkarsa, intrakraniyal basınçta bir düşüşe neden olur ve herhangi bir BOS sızıntısı deneysel sonuçları değiştirir.

3. Farenin görüntüleme için hazırlanması

NOT: Protokol, görüntüleme deneyinin anestezi uygulanmış (Adım 3.1'den başlayın) veya uyanık (Adım 3.2'den başlayın) bir farede gerçekleştirilip gerçekleştirilmeyeceğine bağlı olarak değişir.

1. Anestezi uygulanmış Mmouse
   1. Şırınga pompasından CM kanülüne kadar olan hatta herhangi bir bükülme olmadığından ve izleyici infüzyonunu etkileyebileceğinden gergin olmadığından emin olarak kafa tutucuyu makroskopun sahnesine yerleştirin.
   2. Solunum hızını ve mukoza zarının pembe renklenmesini gözlemleyin, bu da iyi oksijenlenmeyi gösterir. Gerekirse hidrasyon seviyesini güvence altına almak için deri altına salin enjekte edin. Hayvanın yeterince anestezi aldığından emin olmak için kontrol edin ve gerekirse yeniden doz verin.
   3. Makroskop kamerayı ve ışık yayan diyotu (LED) açın ve CANLI modunu başlatın.
   4. Görüntüleme alanının büyütüldüğünü, alanın üst kısmındaki nazofrontal sütür ve alttaki lambdoid sütür, sagital sütür görüntünün ortasına paralel ve ortalanmış olarak net bir şekilde görüntülenebilecek şekilde onaylayın (Şekil 1C). Yerine oturduktan sonra, kafa tutucuyu makroskop aşamasına bantla sabitleyin.
   5. Makroskopu açıkta kalan kafatasına odaklayın. Makroskopların nispeten geniş bir alan derinliğine sahip olmasına rağmen, farenin kafatasının eğriliği yalnızca belirli bir alanın odakta olmasına izin verir. En iyi sonuçlar, fokal düzlem koronal sütürlerin arkasındaki parietal kemiklerin lateral taraflarında yer aldığında elde edilir.
      NOT: Bu, çoğu BOS girişinin meydana geldiği orta serebral arterlerin (MCA) yeridir (Şekil 1D, E).
2. Uyanık Fareler
   1. Görüntüleme seansından önce, hayvanların kafa plakası ameliyatından itibaren en az 24 saat iyileşmesine izin verin. Daha uzun iyileşme süreleri (5-7 gün) de önerilir. Bu süre zarfında, fareyi, iyileşme süresi boyunca günde 0,5-1 saat boyunca emniyet tüpündeki sahneye baş sabitlenecek şekilde eğitin.
      NOT: Alışkanlık, farenin anestezi olmadan kafa tutucuya takılmasına izin verir ve gerçek deney sırasında stres ve kaygıyı azaltır. Bu mümkün değilse ve anestezi deneyi engellemezse, fareyi kafa aşamasına hızlı bir şekilde bağlamak için inhale bir anestezik indüksiyon dozu (ör., 1-2 L / dak O2 akış hızında izofluran% 2) kullanılabilir.
   2. Fare baş tutucuya ve emniyet borusuna sabitlendikten sonra Adım 3.1.1-3.1.5'i izleyin.

4. Floresan BOS izleyicilerinin infüzyonu

1. Akut CM Kanülasyonu
   İzleyici,
   1. Adım 1.6'da cisterna magna'ya yerleştirilmeden önce kanüle zaten yüklenmiş olduğundan, infüzyon pompasını istenen oran ve hacme ayarlayın. Rutin olarak kullanılan infüzyon paradigmaları 1-2 μL / dk'da 5-10 μL'dir, ancak bu parametreler belirli deneye veya hayvanın boyutuna ve yaşına bağlı olarak ayarlanabilir.
2. Kronik CM Kanülasyonu
   1. Görüntüleme seansına başlamadan önce, izleyicileri iletmek üzere infüzyon hattını hazırlamak üzere akut deneyler için Adım 1.2-1.7'yi izleyin.
   2. Hat hazırlandıktan sonra, bir hemostat kelepçesi kullanarak kronik CM kanülünün kapalı ucunu kesin. Adım 4.2.1'de hazırlanan çizgiden iğneyi alın ve yavaşça kanülün içine yerleştirin. Kelepçeyi serbest bırakın ve şırınga pompasını kullanarak, BOS izleyiciyi istenen infüzyon hızında ilerletin (örn., 2 μL/dak) izleyici CM'deki implante edilmiş iğneye ulaşana kadar deney için.
      DİKKAT: Hattı bağlarken iğne boruyu delerse, iğneyi çıkarın, delinmiş segmenti kesin ve bu adımı tekrarlayın. PE10 hortumundaki herhangi bir yırtılma, sızıntıya neden olacak ve deneyin sonuçlarını etkileyecektir.

5. Görüntüleme Oturumunun Ayarlanması

1. İnfüzyon yapılan floresan izleyiciye bağlı olarak, her kanal için uyarma dalga boyunu ve maruz kalma süresini belirleyin. Zaman atlamalı görüntülemenin zamansal çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak için izleyiciyi görselleştirmek için gereken en kısa pozlama süresini seçin. Bu maruz kalma süresi, farklı hayvanlar arasındaki BOS taşınmasını karşılaştırmayı amaçlayan sonraki tüm deneyler için kullanılacaktır.
   NOT: Bir ipucu, maruz kalma süresini ayarlamak için CM hattındaki izleyiciyi kullanmaktır. Bu yararlı bir ilk yaklaşım olsa da, zaman içinde optimize edilmelidir.
2. Denemenin süresini ve görüntülerin alınacağı aralıkları seçin. Deneyler normalde glifatik taşınmanın hangi aşamasının ilgilendiğine bağlı olarak 30-60 dakika sürer. Çoğu deney için 1 kare/dk ve daha yüksek kare hızları yeterlidir.
3. Dosya adını ve kaydetme dizinini ayarlayın.
4. Görüntüleme, diğer değişkenlerin (örn. elektrokardiyogram, arteriyel kan basıncı, elektrofizyoloji) aynı anda elde edilmesine ek olarak toplanacaksa, makroskop ve pompa veri toplama yazılımı ile tetiklenecek şekilde programlanabilir. Bir sonraki adıma geçmeden önce makroskop üzerindeki tetikleme işlevinin doğru olup olmadığını kontrol edin.

6. Transkraniyal optik görüntüleme deneyi

1. : İzleyici infüzyonunu ve görüntülemeyi aynı anda başlatın.
2. CM kanülünü ve PE10 hortumunu herhangi bir sızıntı belirtisi açısından rutin olarak kontrol edin. CM'de herhangi bir izleyici sızıntısı varsa, bu deneyden elde edilen sonuçlar hariç tutulmalıdır.
   NOT: İzleyici beyincikte birikmeye başlarsa ve orta serebral arterlerin (MCA) glifatik yolunu geçmezse, CM kanülünün beyincik içine enjekte edilmiş olması muhtemeldir. Bu veriler dahil edilmemelidir.
3. Akut deneyler için, deneyin tamamlanmasından sonra, fareyi mikroskoptan çıkarın ve hala yeterince anestezi uygulanıp uygulanmadığını kontrol edin. Farenin başını hızla kesin ve beyin dokusunu toplayın. Beyni gece boyunca 4 °C'de %4 paraformaldehit (PFA) içine daldırarak sabitleyin.
   1. Kronik deneyler için, görüntüleme tamamlandıktan sonra CM hattını kanülden çıkarın, steril aCSF ile yıkayın ve CM kanülünü yüksek sıcaklıkta bir koter ucuyla yeniden kapatın. Fareyi baş standından çıkarın ve kafesine geri koyun. Daha fazla görüntüleme gerekmeyene kadar bu işlemi tekrarlayın ve ardından Adım 6.3'ü izleyin.

Sonuçlar

Şekil 1. Transkraniyal makroskopik görüntüleme. (A) Makroskopik görüntüleme kurulumunun şeması. (B) Kafa plakasının kafatası üzerindeki konumunun dorsal görünümü. İnterparietal kemik ve burun, frontal ve par...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.25% Bupivakain HCl			Rochester Üniversitesi Vivarium
100 μL Gaz Geçirmez Şırınga Modeli 1710 TLL, PTFE Luer Kilidi	Hamilton Şirketi	81020
A-M Sistemleri Dental Çimento Tozu	Fisher Scientific	NC9991371
Carprofen			Rochester Üniversitesi Vivarium
Klorheksidin	Prevantics	B10800
CMOS Kamera	Hammamatsu	ORCA Flash 4.0
Kafa Plakası	Rochester Üniversitesi	Katalog yok #	Rochester Üniversitesi'ndeki makine atölyesinde özel olarak üretilmiştir
Yüksek Sıcaklık Koteri	Bovie Medical Corporation	AA01
Insta-set Hızlandırıcı	Bob Smith Industries	BSI-151
Isofluran - Fluriso	Vet One	502017	Rochester Üniversitesi Vivarium
Ketamin			Güçlü Memorial Hastanesi Eczane
Krazy Tutkal	Elmer'in Ürünleri, Inc	Katalog yok #, yorumlardaki bağlantıya bakın	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Mikro gözenekli Cerrahi bant	Fisher Scientific	19-027-761
Paraformaldehit	Sigma-aldrich	P6148
PE10 - Polietilen .011" x .024" / ft., 100 ft sürekli	Braintree Scientific	PE10 100 FT
Pompa 11 Yalnızca Elit İnfüzyon Çift Şırınga	Harvard Cihazı	70-4501
PURALUBE VET MERHEM	Dechra
Puritan PurSwab Pamuk Uçlu Temizleme Çubukları	Fisher Scientific	22-029-553
Araştırma Makro Zoom Mikroskobu	Olympus	MVX10
Basit Kafa Tutucu Plaka (fareler için)	Narishige International USA Inc	MAG-1
Tek Kullanımlık İğneler, BD Medical	VWR	BD305106
Steril Alkol Hazırlama Pedleri	Fisher Scientific	22-363-750
Ayarlanabilir LED	ÖNCEKİ Lümen 1600-LED
Ksilazin			Rochester Üniversitesi Vivarium