$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Kemirgen İntravenöz Kateterizasyonu, Virüs Dağıtımı ve Optik Fiber İmplantasyonu
- Hayvanları ameliyata hazırlayın.
- Sıçanları, kurumsal yönergelere dayalı olarak tercih edilen anestezik ile tamamen uyuşturun. Bir seçenek ketamin hidroklorür (87.5-100 mg / kg, kas içi [im]) ve ksilazin hidroklorürdür (5 mg / kg, im). Ayak parmağını kıstırma refleksi olup olmadığını kontrol ederek farenin tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
DİKKAT: Ketamin, kurumsal yönergelere göre ele alınması gereken kontrollü bir maddedir.
NOT: Bu çalışmada intramüsküler anestezik enjeksiyonları, intraperitoneal enjeksiyondan daha hızlı ve güvenilir bir anestezi indüksiyonu sağladıkları için kullanılmıştır. Sıçanın solunumunu ve yanıt verme durumunu sürekli olarak izleyin ve ameliyat boyunca termal destek sağlayın. - Sıçanın sırtının geniş bir alanını (kürek kemiklerinin hemen üstünden sırtın ortasına kadar üst sırt) ve ayrıca sağ ön ayağın altındaki boyun bölgesini ve kafa derisini tıraş edin.
- Fareyi cerrahi alana yerleştirin ve gözlere puralube (yapay gözyaşı) uygulayın. Üst sırtın derisinden deri altına (deri altı [sc]) vücut ağırlığı hacminde bir karprofen (analjezik) enjekte edin, ardından 5 mL Laktated Ringer solüsyonu sc alt sırtın derisinden enjekte edin.
- Bir parça steril gazlı bezi betadin ile ıslatarak ve dairesel bir hareketle traşlı cerrahi alanı silerek tüm cerrahi bölgeleri sterilize edin. Ardından işlemi %70 etanol ile tekrarlayın. Bu alternatif döngüyü üç kez tekrarlayın.
- Daha önce yayınlanmış protokollere göre intravenöz kateter implantasyonu gerçekleştirin.
NOT: Kateter implantasyonu sırasında tahrişi önlemek için bu ameliyat sırasında cerrahi örtü kullanılmaz. Kullanmadan önce tüm alet ve ekipmanları sterilize edin. Steril eldiven kullanın ve steril olmayan herhangi bir yüzeye temas edilirse eldivenleri değiştirin. - Kateter implantasyonlarının hemen ardından, Adeno ilişkili virüs (AAV) enjeksiyonlarını gerçekleştirmek için fareyi stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin.
- Lokal anestezik olarak kafa derisine %2'lik lidokain (0.2-0.3 mL) deri altı (s.c.) enjeksiyonu yapın.
NOT: Cerrahi sonuçlarda değişiklik olmasını önlemek için intravenöz kateter implantasyonu sırasında lokal anestezik kullanılmaz. - 26 gauge paslanmaz çelik enjeksiyon kanülünü 1 μL konsantre AAV çözeltisi ile doldurulmuş bir Hamilton şırıngaya bağlayın: AAV5-hSyn-tdTomato veya AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
NOT: oChIEF, geniş bir frekans aralığına yanıt verebilen mavi ışığa duyarlı opsin channelrhodopsin'in (ChR2) bir çeşididir ve bu nedenle bu protokolde tartışılan düşük frekanslı uzun süreli depresyon (LTD) deneyleri için faydalıdır, aynı zamanda yüksek frekanslı uzun vadeli potansiyasyon (LTP) deneyleri için de geçerlidir. oChIEF yapısı Dr. Roger Tsien tarafından bağışlandı ve Duke Viral Vector Core tarafından paketleme ve saflaştırma için işlendi. Talamus (MGN) akson terminallerinin medial genikülat çekirdeğinde optimal virüs ekspresyonuna izin vermek için enjeksiyon günü ile LTD indüksiyon günü arasında en az 3-4 haftaya ihtiyaç vardır.
DİKKAT: Genel olarak AAV, üretiminde yardımcı bir virüs kullanılmadıkça kendi kendine enfeksiyon riski düşük olan bir Biyogüvenlik Seviyesi 1 (BSL-1) organizması olarak kabul edilir. Kullanımı, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) onayını gerektirir ve gereksiz maruziyeti sınırlamak için kurumsal yönergelere uygun olarak her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanılmalıdır. - Bir neşter kullanarak, kafatasının önünden arkasına 0,5 mm'lik bir kesi yapın ve kafatasının yüzeyini ortaya çıkarmak için üstteki dokuyu çıkarın.
- Sıçanın kafasını ön / arka eksende düzleştirin ve bregmaya sıfır stereotaksik koordinatlar.
- Küçük bir matkap ucuyla donatılmış bir Dremel aleti kullanarak kafatasına üç küçük delik açın. Paslanmaz çelik vidaları (M2x4 965-A2) yerine sıkıca monte etmek için tornavida kullanın.
NOT: Diş çimentosunun düzgün bir şekilde bağlanması ve sağlam, uzun ömürlü başlıkların oluşturulması için vidalar gereklidir. Vidaların pozisyonu kafatasının ön-arka ekseni boyunca ve AAV enjeksiyon bölgesinden uzağa yayılmalıdır. - Medial genikülat çekirdeğin (MGN) medial kısmı için Sıçan Beyin Atlası'ndan (Watson ve Paxinos) alınan koordinatlara dayanarak AAV enjeksiyonu için iki taraflı delikler açın; bregmadan mm cinsinden, anteroposterior (AP): -5.4; mediolateral (ML): ±3.0; dorsoventral (DV): -6.6. Enjeksiyon kanüllerini MGN'ye yerleştirilene kadar yavaşça indirin (4 mm / dak). Konsantre AAV çözeltisini 0.1 μL/dk oranında enjekte edin.
- Kanülden difüzyona izin vermek için infüzyonlar tamamlandıktan sonra enjeksiyon kanülünü 5 dakika yerinde bırakın ve ardından kanülü beyinden yavaşça çekin.
- Virüs enjeksiyonlarının hemen ardından, MGN-LA terminallerini hedef alan optik fiberleri implante etmeye devam edin.
- Lateral amigdalayı hedefleyen optik fiber implantlar için iki taraflı delikler açmak için bir Dremel aleti kullanın (bregma'dan mm olarak, AP: -3.0; ML ±5.1).
- Optik fiber implantın yüksüğünü tutmak için forseps kullanın ve güvenli bir şekilde yerinde tutulmaları için stereotaksik adaptörlere sabitleyin.
- Lifin ucu LA'nın dorsal kısmına oturana kadar lifleri 2 mm / dak hızında yavaşça indirin (dorsoventral [DV]: -7.9 mm).
- Yüksükleri önce ince bir Loctite anında yapıştırıcı tabakası, ardından diş çimentosu kullanarak kafatasına sabitleyin ve yüksükleri 1,25 mm çapında yüksük manşonları ve toz kapakları ile örtün.
NOT: Yüksükleri kafatasına sabitlemek için yapıştırıcı seçimi, yerel veya kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylanmalıdır. Bu çalışma için, birden fazla yapıştırıcı ile deneme yanılma işleminden sonra yüksükleri kafatasına güvenilir bir şekilde sabitlemek için loctite kullanılır; Ancak, mevcut alternatifler düşünülebilir.
- Cerrahi prosedürleri takiben, ev fareleri tek tek yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlar. Kurumsal yönergelere uygun olarak ameliyat sonrası bakım sağlayın. Açıklığı korumak için kateterleri günlük olarak gentamisin (5 mg / mL) ve heparin (30 USP / mL) içeren salin ile yıkayın. Ameliyattan en az 5 gün sonra ve davranışsal deneylerin başlamasından 24 saat önce, yiyecekler fareleri serbest beslenme ağırlıklarının ~% 90'ı ile sınırlar.
2. Kemirgen Kokainin Kendi Kendine Uygulama ve Aletli Kol Yok Olması
NOT: Tüm davranışsal prosedürler, bir duvarda iki geri çekilebilir kol, her kolun üzerinde bir uyaran ışığı, bir ton üreteci, bir ev ışığı ve bir infüzyon pompası ile donatılmış standart edimsel koşullandırma odalarında gerçekleştirilir.
- Sabit oranlı bir program 1 (FR1) pekiştirme programı altında fareleri günlük 1 saatlik kokain (2 mg/mL) kendi kendine uygulama eğitim oturumlarına tabi tutun.
- Fareleri her gün bir çalışma odasına yerleştirin ve farelerin kolla basmasına izin verin. Belirlenen 'aktif kola' (sol ve sağ kollar arasında dengelenmiş) bir basış, bir kokain infüzyonu (1.0 mg / kg / infüzyon) ve 10 s'lik bir bileşik ışık ve ton ipucu sunumu ile sonuçlanır. Belirlenen 'etkin olmayan kola' basılmasının programlanmış bir etkisi yoktur.
- En az 10 gün boyunca kendi kendine uygulama deneylerine devam edin ve sıçanlar art arda 3 gün boyunca günde en az 8 infüzyon kazanana kadar devam edin. 20. güne kadar edinme kriterlerine ulaşılamaması, çalışmadan dışlanmaya neden olur.
- Edinme kriterleri başarıyla karşılandıktan sonra, sıçanları 6-10 gün boyunca 1 saatlik aletli yok olma seanslarına tabi tutun.
- Sıçanları edimsel odalara yerleştirin ve sıçanların serbestçe basmasına izin verin. Bununla birlikte, hem aktif hem de aktif olmayan kaldıraçlara verilen yanıtların programlanmış bir sonucu yoktur.
- Sıçanların, art arda iki gün boyunca ortalama < 25 kol basması gerçekleşene kadar günlük olarak aletsel yok olmaya devam etmesini sağlayın.
3. LTD'nin in vivo Optogenetik İndüksiyonu
NOT: Optogenetik inhibisyon deneyleri, aletli yok oluşun son gününden 24 saat sonra gerçekleşir.
- Yama kablolarını, kapağı çıkarılmış temiz, standart bir kemirgen muhafaza kafesinin üzerinde asılı duran döner bir bağlantı aracılığıyla 473 nm mavi lazer diyota bağlayın. Bu kurulum, optogenetik stimülasyon sırasında kemirgenlerin kafes etrafında serbestçe hareket etmesine izin verir.
- Lazer diyotu çalıştırma talimatlarına göre açın ve bir darbe üretecine bağlayın. Ayarları, açıldığında sıçan 1 Hz'de 900 adet 2 ms ışık darbesi alacak şekilde ayarlayın.
DİKKAT: Lazeri çalıştırırken her zaman uygun göz koruması kullanılmalıdır. - Bir ışık sensörü kullanarak yama kablosundan ışık yoğunluğunu ölçün. Lazerin yoğunluğunu, yama kablosundan geçen ışık çıkışı ~5-7 mW olacak şekilde ayarlayın.
- Fareleri temiz bir muhafaza kafesine yerleştirin. Yüksükleri açığa çıkararak toz kapaklarını ve yüksük manşonlarını çıkarın. Yama kablolarını iki taraflı olarak fiber optik implantlara bağlayın. LTD indüksiyonundan önce farelerin çevreyi 3 dakika boyunca keşfetmesine izin verin.
- Optogenetik stimülasyonu başlatmak için nabız üretecini açın.
NOT: Olası olmasa da, sıçanlar stimülasyona karşı herhangi bir olumsuz reaksiyon yaşarsa, deney derhal sonlandırılır ve sıçanlar kurumsal yönergelere göre uygun şekilde ötenazi yapılır. - LTD indüksiyonunu takiben, fareleri 3 dakika kafeste tutun ve ardından onları ev kafeslerine geri koyun.
- Kontrol deneyleri için, AAV5-tdTomato kontrol virüsünü eksprese eden sıçanlar üzerinde aynı stimülasyon prosedürünü kullanın. Sahte deneyler için, AAV5-oChIEF virüsünü eksprese eden sıçanların optik fiberine bir yama kablosu takın, ancak 15 dakikalık bir seans sırasında herhangi bir stimülasyon sağlanmaz.
4. Optogenetik Stimülasyonun İşaret Kaynaklı Kokain Arayışı Üzerindeki Etkisini Test Edin
- in vivo optogenetik stimülasyonlardan >24 saat sonra, fareleri tekrar edimsel koşullandırma odalarına yerleştirin. Sıçanlar, kokain arama davranışını değerlendirmek için 1 saatlik standart işaret kaynaklı eski haline getirme seansına tabi tutulur.
NOT: İşaret kaynaklı eski haline getirme sırasında, aktif kol üzerindeki bir yanıt, kokainle ilişkili işaretin 10 saniyelik bir sunumunu verir, ancak kokain infüzyonu olmaz. - Optogenetik LTD indüksiyonunun kokain arayışının uzun süreli baskılanmasına yol açıp açmadığını belirlemek için ilk testten en az 1 hafta sonra ikinci bir eski haline getirme testi yapın