Üç Fotonlu Floresan Mikroskobu Kullanılarak Bir Zebra Balığı Beyninin Derin Doku Görüntülemesi

Abstract

Kaynak: Hontani, Y., et al. Sağlam fare ve zebra balığı beyninde derin doku üç fotonlu floresan mikroskobu. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, anestezi uygulanmış bir zebra balığı beyninde üç fotonlu görüntülemenin kurulumunu ve yürütülmesini göstermektedir. Protokol, floresan etiketli nöronların derin doku görselleştirmesini sağlayarak, sinirbilim araştırma uygulamaları için gerçek zamanlı nöronal aktiviteyi ve yapıları ortaya çıkarır.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Zebra balığı beyninde intravital görüntüleme
   NOT: Balık beynini objektif merceğin altına düzgün bir şekilde yerleştirmek için, geniş alan görüntüleme için uyarma ışığıyla aynı yolda ikincil bir şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamerası kullanılır.
   
   1. Mikroskobu kurun ve gücü kalibre edin.
   2. Mikroskoba düşük büyütmeli (tipik olarak 4x) bir objektif yerleştirin.
   3. Balıkları ve tüpleri içeren Petri kabını mikroskop altına yerleştirin.
   4. Petri kabını aydınlatmak için bir ışık yayan diyot (LED) ışık kaynağı kullanın.
   5. Görüntü alma yazılımının Kamera modunu açın (Şekil 1).
   6. Canlı'ya tıklayın.
   7. Ekranın sağ tarafındaki A kanalını seçin.
   8. Görüntüyü net bir şekilde görmek için histogram ayarlarını yapın.
      NOT: Bunların gerektiği gibi güncellenmesi gerekir.
   9. Motor kontrol cihazındaki motor ayarını Base (Taban) olarak ayarlayın.
   10. Balık görünene kadar objektifi indirin.
       NOT: Objektif merceğinin kafa ile herhangi bir fiziksel temas kurmadığından emin olun.
   11. Balık kafasının merkezini görüş alanının ortasına yerleştirin.
   12. Hedefi yukarı ve balık kafasından uzaklaştırın.
   13. Düşük büyütmeli objektif merceğini, 3PM (üç foton mikroskobu) için yüksek sayısal açıklıklı (NA) objektif merceğiyle değiştirin.
       NOT: Düşük büyütmeli merceğin ve yüksek NA objektif merceğinin parfokal olması gerekmez, ancak balığın yüksek NA objektif merceğinin görüş alanı içinde olmasını sağlayacak kadar yakın olmalıdır.
   14. Objektif merceğini yavaşça indirin ve objektifin kafa ile herhangi bir fiziksel temas kurmadığından emin olun. CCD kamera yazılımında, başın üst kısmı göründüğünde objektifi hareket ettirmeyi durdurun. Z konumunu 0 μm.
       NOT: Suya daldırma objektifi kullanırken objektif merceğinin altında hava kabarcığı olmadığından emin olun.
   15. LED ışık kaynağını kapatın ve sistemin etrafındaki karanlık perdeyi kapatın.
   16. 3P görüntüleme için görüntüleme toplama yazılımını Multiphoton GG moduna ayarlayın ve objektif lensin altındaki gücü 1 mW'tan daha düşük bir değere ayarlayın (~1 MHz darbe tekrarlama oranı ile).
   17. Motor kontrol cihazındaki motor ayar düğmesini Base'den Objective'e değiştirin.
   18. Odadaki ışıkları kısın.
   19. Fotoçoğaltıcı tüpleri (PMT'ler) açın ve 3PM uyarma kaynağı deklanşörünü açın. Otofloresan nedeniyle floresan sinyal kanalında ve kemiğin THG'si nedeniyle üçüncü harmonik üretim (THG) sinyal kanalında kemiğin bir taslağının göründüğünden emin olun (Şekil 1C).
   20. Daha derin görüntüleme yaparken güç seviyelerini artırarak farklı derinliklerde görüntüleme gerçekleştirin.

Results

Şekil 1: Balıklarda intravital Görüntüleme için temsili ekran görüntüleri (protokol bölüm 1). (Bir) 4x objektif lens yerinde iken görüntü elde etme yazılımının kamera modu görünümü. Yazılımın temel özellikleri aşağıdaki gibi...

Materials