$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Fare spinal transeksiyonu modeli
- Yetişkin, erkek, C57BL6 fareler (yaklaşık 20-25 gr), ketamin (200 mg / kg) ve ksilizin bir arada kullanarak anestezi (10 mg / kg). Tüm cerrahi işlemler, steril koşullar altında bir Kurumsal IACUC onaylı cerrahi seti yapılır.
- Bir kez derin anestezi, arka kürk elektrik kesme makineleri kullanılarak kesilmiş. Traş arka% 70 etanol ile takip iyot çözeltisi ile ilk temizlendi.
- Ilk kesi önce, kesilecek arka alanda ilk ameliyat sonrası ağrı en aza indirmek için bir konsantrasyon (% 0,25 <1ml/kg), bir lokal anestezik (Marcaine) ile infiltre edilir.
- Küçük bir makas kullanarak, küçük bir delik L2 alanı çevresinde deride yapılır. Bu açılış, T2 alanı boydan boya uzanan, aynı makas ile genişletilir. Cilt kenarları daha sonra bulldog kelepçeler kullanımı yoluyla ayrı tutulur.
- Micro-makas kullanılırtorasik seviye 8 (T8) dorsal spinal lamina kas dokusu temizlemek için. Kuh ve Wrathall (1998) 10 açıklandığı gibi T8 tespit edilebilir. Kısaca, T13, dorsal spinöz işlemi tarafından tespit edilebilir. # 5 Dumont forseps bir çift kullanarak, son kaburga palpe / tanımlanır ve T8 için geri sayılır olabilir. Gümrükten geçtikten sonra kemik Rongeurs T8 dorsal laminektomi gerçekleştirmek için kullanılır.
- Tam Spinal transeksiyonu Lezyon sonra omurilik sterilize mikro-makas ek bir cerrahi bir mikroskop altında kablosu uzun eksenine dik düzlem omurilik sever için kullanılır, T8 az maruz kalmaktadır. Biz nazikçe lezyonun eksiksiz onaylamak için omuriliğin bir kutup kaldırmak için # 5 Dumont forseps kullanırlar.
- Spinal transeksiyonu, steril serum fizyolojik ile ıslatılmış steril gelfoam küçük bir parça (% 0.9) ardından dikkatli bir hemostaz teşvik etmek lezyon boşluğuna yerleştirilir.
- Gelfoam ek bir parça daha sonra maruz kalan Spin üzerine yerleştiriliral kablosu. Deri daha sonra steril, paslanmaz çelik cerrahi zımba ile kapatılır. Daha sonra denekler evlerinde kafeslerde iade yatak malzemesi aspirasyonu önlemek için kağıt havlu üzerine yerleştirilir ve yaklaşık 12 saatlik bir süre için ısıtma pedi ile ısındı. Hastalar da erken kurtarma sırasında kendi kafeslerinin katta Hidrojel paketleri (ClearH2O) ve gıda pelet ile sağlanır. Sakat konularda evlerinde kafeslerde gıda / su bir kez anestezi kurtarıldı erişmek mümkün.
- Tüm yaralı konularda çalışma süresi (40 gün), manuel Crede yöntemi bir değişiklik kullanarak günde iki kez elle mesane tahliyeler (yaklaşık 12 saat aralıklarla) alırsınız.
- Yaralı fareler aynı zamanda hidrasyon korumak yardımcı olmak için üç gün (0.5 cc) için, tuzlu su 0.9%, günde iki kez intraperitoneal enjeksiyonu ile verilir ve opiat buprenorfin iki günlük enjeksiyonlar bir süre için ameliyat sonrası ağrı kontrolü için (0.05 mg / kg) 5 gün. Hayvanları işaretler o gösterirlersef ağrı, ilk 5 günlük bir süre sonra, ağrı belirtileri (ele hareketliliğin azalması, hunched boy, damat, seslendirme başarısızlık) kadar günlük ek buprenorfin (0.05 mg / kg) alacak giderilmiştir.
2. Spinally transeksiyon fareler aynı kohort IVIS Lumina XR kullanarak kemik yoğunluğu Boyuna değerlendirme
- Gün 10 SKY sonrası başlayan ve 40 gün kadar 10 gün aralıklarla devam eden, sağ ve sol femur ve yaşam süresince tibialar, anestezi konular (transeksiyonu SCI ve yaralanmamış bir şekilde yaş eşleştirilmiş kontrol grubu) değerlendirdi.
- Tarama gününde, denekler evlerinde kafeslerde Kurum Vivarium alan kaliper IVIS Lumina XR ev sahipliği olduğu odaya transfer edildi. Tüm denekler, daha önce SCI teslim kullanılan aynı Ketamin / ksilizin kokteyl ile daha sonra anestezi. Bu kokteyl, 1 ila 1.5 saat arasında bir süre için anestezi durumuna sağlar; scann süresi için yeterliing prosedür.
- Araştırmacı Lumina XR cihazı başlatır ve dahili kamera, çalışma sıcaklığı (-90 ° C) (~ 10 dakika) ulaşmasını sağlar.
- Bir kez anestezi, konuyu (transection veya kontrol) hafifçe Lumina XR içinde hayvan platform üzerinde yer almaktadır. Femur ve tibia bölgelerinde (yüksek büyütmeli objektif ile görüntüsü 2.4X2.4cm Alanı) hem de yüksek büyütme lens odak izin cihazın içine sokulur. Konu yanlış görüş alanının dışına yerleştirilmiş ise, kapı açılır ve sol ya da sağ arka ekstremite merkezli kadar (arka bacak uygun yerleşimi için Şekil 2a) yeniden konumlandırılan konu.
- Doğru konumda, X-ray işlevi yürütür. Hayvan için uygun (Oturma konu, 35 Kv 100uA, X-Rays süzülmüş) Enerji açılan listesinde bir seçim yapın
- Hayvan doğru pozisyonda sonra, check-işaretleme X-Ray X-ray özelliği etkinleştirmekkontrol paneli. X-ray görüntü elde edin. Tüm femur ve tibia (bkz. Şekil 2b) görünür olduğundan emin olun. Ham görüntü verileri otomatik olarak sabit diske kaydedilir. Temsilcisi. TIFF dosyaları da kaydedilir. Fare, sonra eve kafes döndü ve araştırmacı gözlem altında kurtarmak için izin verilir. Süreç, daha sonra sonraki fare ile tekrarlanır.
Not: The Living Image yazılımı, varsayılan olarak dönüştürülmüş X-ray görüntüler. Düzeltmeler / Filtreleme araçları, X-Işını Absorbsiyon ham X-ray görüntüleri görüntülemek için, yanındaki onay işaretini kaldırmak . X-ray veri emilimi için giderilmiştir, bağıl kemik yoğunluğu ölçümü ROI'ler sinyal intensitesi karşılaştırarak değerlendirmek. ROI yoğunluğu artan doku yoğunluğu ile artar.
3. IVIS X-ray taramaları Görüntü analizi
- Yaşayan Görüntü simgesine çift tıklayarak yazılımı açın.
- Tıklayarak bir X-ray görüntü yükleyin Tamam'a tıklayın. Yaşam Görüntü tarayıcı kullanıcı kimliği, etiket bilgileri ve kamera yapılandırma bilgileri ile birlikte seçilen verileri görüntüler. Aşağıdaki verileri açmak için birini yapın: veri satırı çift tıklatın, veri adını sağ tıklatın ve kısayol menüsünde Yük seçin, veri satırı seçin ve Yükle'yi tıklatın ya da minik resmini çift tıklatın . Görüntü ve Aracı Paleti görüntülenir. Açık veri tarayıcı yeşil vurgulanır.
- Aracı Paleti ROI Araçları tıklayın. ROI Araçları Türü açılan listesinden seçin Ölçüm ROI. Bu deneyde kullanılan 3 ROI yüklemek için, Kare simgesini tıklatın ve yük 3 kareler.
- Bir cetvel kullanarak, femur uzunluğunu ölçmek. Toplam femur uzunluğu 1 / 8 inci karelerinin iki uzunluğunu ayarlayın. Toplam femur uzunluğu 1/24th bu iki kare genişliğini ayarlayın. Cetvel ile, 1 / 8 ölçü femur proksimal ucundan mesafe inci ve kare femur içinde ortalanmış şekilde bulunurdu. Femur distal ucu (Şekil 3) elde edilen toplam femur uzunluğu 1/4th yatıyor böylece ikinci kare bulunurdu. Bu ROI hem proksimal ve distal femur bölgeleri ölçmek için kullanılabilir.
- Cetvel kullanarak, tibia uzunluğu ölçer. Tibial toplam uzunluğunun 1 / 8 th olmak için üçüncü kare uzunluğu ayarlayın. Genişliği, toplam tibial uzunluğu 1 / 30 th ayarlayın . Kare bulunurdu çok merkezli ve 1 / 8 th toplam uzunluğu, tibia proksimal sonunda (bkz. Şekil 3) tibia mesafe olduğundan emin olun .
- (Bir kalem ve cetvel) Ölçü simgesini tıklayın. ROI yoğunluğu ölçümleri, X-ray görüntü görünür ve ROI ölçümleri tablo görünür. Bu tablo t İhracat. csv dosyası olarak istenen konuma o. Bu excel kullanarak tablo açmak için izin verecektir.
- Tüm kaydedilmiş görüntüler ile bu işlemi tekrarlayın.
- Bir excel kağıda tüm verilerinizi birleştirin. Microsoft Excel veya SigmaPlot 11.0 yazılımı (Systat Yazılım) ya da öğrenci t-testi ile istatistiksel anlamlılık tespit edildi.
4. Post-mortem kemik yoğunluğu analizi:
- IVIS Lumina XR içinde son uzunlamasına X-ray tarama satın alınmasının ardından, fareleri Beuthanasia (pentobarbital 75 mg / kg) ile daha sonra derin anestezi. Derin anestezi sağlandıktan sonra, farelerin transcardially buzlu-soğuk ile perfüze olan fosfat tamponlu salin heparain (40 mg / litre) ile asıl bulbus olfaktoryusları alındı.
- Bir kere exsanguinated, tüketim hem de femur. Yoğunluğu ölçümü 11 etkiler kanıtlanmıştır için, mümkün olduğunca yumuşak doku kaldırmak için özel dikkat edin. Suya batırılmış gazlı bez ve mağaza ile femur sarın-20C onları analiz etmek için hazır olana kadar.
5. Hologic QDR 4000 Kemik Dansitometre kullanarak DXA Analizi
- Çözülme gazlı bez bulanmış femur ve Kemik Dansitometre, takımı için transfer.
- Üretici protokolüne göre cihazın kalibre, BMC ve BMD değerleri kabul edilebilir sınırlar içinde kalan emin.
- Makine pirinç kolimatör yerleştirin. Bu kullanıcı, belirli bir hedefe odaklanmak için X-ışını boyut ve açı sınırlamak için izin verir.
- Batmak, su (sol kondiller, yatağa paralel femur) ve sadece lazer sağ konumu ile dolu bir Petri kabı içine çözülmüş femur.
- Femur taramak için bir Özgeçmiş (hayvan kimlik bilgileri, tedavi, vb içeren açıklayıcı bir başlık) girin.
- Seçimler Menü Tarama girin, sonra regionA hi-res seçin. Tarama parametrelerini belirtiniz: 0,01 inç satır aralığı ve 0,00499 inç nokta çözünürlüğü ile, 2 x 0,7489 inç bölgesi tarama.
Not: Monitör tarama devam ederken. X-ışını tarama, örnek tarar olarak, kemik örneği tamamen karşılamak için yeterli su haznesi olduğunu sağlamak için monitör. - Analiz Seçim menüsü altında analiz girin. Bir yatırım getirisi olarak tüm femur vurgulamak için yönergeleri izleyin. Bir rapor sayfası hesaplanan BMC (gram) ve BMD (gr / cm 2) ile gelecektir.
- Kalan femur analiz etmek için bu adımları yineleyin.
- Tüm verileri bir excel kağıda pekiştirmek ve istatistiksel analiz (t-testi).
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Naif farelere göre, omurilik hasarı sonrası bir fare tibia ve femur bağıl kemik yoğunluğu kaybı yukarıdaki yöntemi kullanarak saptanabilir. , Kemik yoğunluğunda saptanabilir belirgin azalma sonra40 gün% 15 kadar kemik yoğunluğu kaybı (p <0.0005, Şekil 4) ile sadece 10 gün (% 12, p <0.0005). 40 gün yaralanma (% 7 azalma, p <0.05, Şekil 5) femur kemik yoğunluğu kaybı gözlendi. Bu sonuçlar, omurilik hasarı sonrası kemik yoğunluğu değişim uzunlamasına gözlem için non-invaziv x-ray görüntüleme kullanımı için kanıt.
Şu anda ne bu yöntemin etkinliğini karşılaştırmak amacıyla, 40 gün DXA görüntüleme kullanarak yaralanma sonra bu farelerin eksize femur analiz. Veri çıkışı temsili Şekil 6 görülebilir. Biz orada kemik mineral içeriği ile kıyaslandığında önemli bir kayıp SKY farelerde naif (% 12 azalma, p <0.05, Şekil 7). Kemik mineral yoğunluğu önemli bir değişiklik, ancak benzer bir eğilim (Şekil 8) takip etmedi. Bu sonuçlar literatürde bulunan benzer; Picard ve ark BMC% 13.5 'lik bir azalma (p <0,001) görülmektedir, ancak hiçbir önemli decrBMD (Picard 2008) kolaylığı.

Şekil 1. Deneysel Zaman Çizelgesi.

Şekil 2 sol arka ekstremite Temsilcisi yönelim: a) fotoğraf ve b), x-ray.

Şekil 3 proksimal femur ve tibia bölgeler içinde yatırım getirisi boyutları ve yönlendirme.

Şekil 4 SKY proksimal tibia 10, 20, 30 ve yaralanma sonrası 40 gün sonra kemik yoğunluğu kaybı (n = 5) yaş eşleştirilmiş Naifler göre (n = 5). Hata çubukları SEM temsil eder; ** p <0.005, *** p <0.0005.


Şekil 6, 10, 20, 30 ve 40 gün yaralanma sonrası distal femur SKY sonrası kemik yoğunluğu kaybı (n = 5), yaş olarak eşleştirilmiş naif kontroller ile karşılaştırıldığında (n = 5 ). Hata çubukları SEM temsil eder; * p <0,01-0,05; ** p <,001-,01; *** p <0,0001-,001; **** p <0.0001.

Şekil 7, BMC ve BMD çıkış gösteren DXA veri Temsilcisi görüntü .

Şekil 8 DXA SKY farelerin femur kemik mineral içerik analizi (gram) 40 gün sonrası yaralanma (n = 5) vs yaş eşleştirilmiş Naifler (n = 5).Hata çubukları SEM temsil eder; * p <0.05.

Şekil 9 SKY farelerin femur kemik mineral yoğunluğu DXA analizi (mg / cm 2) 40 gün yaralanma (n = 5) vs yaş eşleştirilmiş Naifler (n = 5). Hata çubukları SEM temsil eder; anlamlı bir fark.