Glioblastoma Dokusunda Tümör Hücresi Migrasyonunun Hızlandırılmış Taramalı Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Parker, J. J., et al. Tümör Hücre Göçü ve Anti-İnvaziv İlaçların Hastaya Özgü Etkilerinin İncelenmesi için Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültür Modeli. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, konfokal mikroskopi ile yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden glioblastoma doku dilimlerinin görüntülenmesini göstermektedir. Tümör hücresi hareketini ve yönünü izlemek için tutarlı aralıklarla yüksek çözünürlüklü görüntüler yakalanır.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Retrovirüs İfade Eden Yeşil Floresan Protein Yoluyla Tümör Hücresi Etiketleme

NOT: Tümör hücresi göçünün analizi için hızlandırılmış mikroskopi, dilim kültürü içindeki hücrelerin kararlı, uzun süreli floresan etiketlemesini gerektirir. Retrovirüsün kullanılması önerilmektedir, çünkü bölünen hücreleri seçici olarak enfekte eder, böylece dilim içinde bulunan mikroglia veya diğer hücre tiplerinin aksine tümör hücresi popülasyonu içindeki floresan etiketlemeyi zenginleştirir. Enfeksiyonun standardizasyonu, 10⁴ CFU / μL'lik bir viral titrenin, hücre göçünün izlenmesi ve analizi için yeterli yeşil floresan protein ekspresyonu ile sonuçlandığını göstermektedir. Artan viral titre, seçici olmayan virüsün (yani adenovirüs, lentivirüs) kullanımı veya tüm hücreleri etiketlemenin diğer yolları, göç sırasında açık hücre sınırlarının tanımlanmasını engelleyebilir ve böylece analizi karmaşıklaştırabilir. Alternatif floresan işaretleyicilerin kullanımı gerektiği gibi kullanılabilir ve optimize edilebilir.

1. Tümör dilimlerinin enfeksiyonu için standart protokoller5,14 veya ticari olarak temin edilebilen bir kaynaktan retrovirüs edinin. 10⁴ CFU (koloni oluşturan birimler) / μL'lik bir viral titre elde etmek için uygun hacmi takviye edilmemiş bir nöronal ortama ekleyerek viral süpernatanı seyreltin.
2. 7-10 günlük kültür, ilgilenilen tümör dilimi kültürlerini 5-10 μL virüs (10⁴ CFU / μL) ile enfekte eder. Virüsü her doku diliminin yüzeyine nazikçe damla damla yerleştirin. Dilim ekin yüzeyinde yüzerse eklenen süpernatan hacmini azaltın. Dilim kültürleri içeren plakaları bir inkübatöre geri koyun.
3. Viral enfeksiyondan 24 saat sonra başlayarak etiketli tümör hücreleri için dilimleri değerlendirin. Bu zaman gecikmesi, viral dahil etme ve floresan gen ekspresyon kinetiğine bağlı olarak değişecektir. Burada kullanılan viral yapılar için, standart bir epifloresan mikroskobu ile sağlam bir floresan sinyalini gözlemlemek için 72 saat gerekliydi.
   NOT: Nadiren, dilimler viral olarak etiketlenmiş hücrelerin ağırlıklı olarak periferik bir dağılımını gösterir ve bu da konfokal görüntülemeyi zorlaştırabilir. Bu komplikasyonu önlemek için, dilim kalınlığını ve dilim boyunca kalınlık değişimini azaltmaya çalışın. Dilim kültürü merkeze yakın daha kalın bir bölgeye sahipse, bu yeterli besin penetrasyonunu önleyebilir ve böylece aktif olarak bölünen tümör hücrelerinin popülasyonunu sınırlayabilir. Bu komplikasyonu taramak için kalitatif bir test, dilim kültür ortamına bir tetrazolyum boya reaktifinin (yani MTT (3- (4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür)) eklenmesidir. Reaktif eklendikten sonra dilimin maviye dönmeyen alanları, metabolik aktivite eksikliğini ve dilim sağlığının tehlikeye girdiğini gösterir.

2. Tümör Hücresi Migrasyonunun Hızlandırılmış Tek Foton Lazer Taramalı Konfokal Görüntülenmesi

NOT: Başarılı transdüksiyon ve kültürün sağlığı doğrulandıktan sonra, hücreler kontrol koşulları altında görüntülenebilir, ardından tedavi koşulları altında eşit bir görüntüleme süresi izlenebilir. Bu protokolü kullanarak, hücreler her durumda 12 saat boyunca başarılı bir şekilde görüntülendi ve izlendi. Bununla birlikte, daha kısa veya daha uzun süreli görüntüleme ve çevresel manipülasyon da bilgilendirici olabilir.

1. Mikroskop
   1. Görüntülemeden önce, 1 mL taze dilim ortamını cam tabanlı bir kaba koyun.
   2. Cam tabanlı çanaktaki ortamın bir inkübatörde 15 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.
      NOT: Bu noktada, floresan konjuge lektinler (yani mikroglia etiketleme için İzolektin IB4) veya ligand konjuge kuantum noktaları gibi çözünür etiketleme maddeleri, görüntüleme sırasında hücresel alt popülasyonların tanımlanması için dilim kültür ortamına eklenebilir.
   3. Görüntülenecek eki, laminer akış başlığında steril forseps kullanarak cam tabanlı bir tabağa aktarın. Çanağı mikroskop aşamasına taşıyın.
   4. Dilim kültürlerini 37 ° C'de ve% 5 CO₂ atmosferinde kapalı bir mikroskop sahne üstü inkübatörde tutun. Aşırı ortam buharlaşmasını önlemek için varsa inkübasyon odasının steril H₂O nemlendirmesini kullanın (özellikle daha uzun görüntüleme deneyleri için önemlidir).
   5. Tek foton ve/veya çoklu foton için uzun çalışma mesafesi 10X hava objektifi ve lazer uyarımına sahip konfokal bir mikroskop kullanın. not: Mikroskop objektif merceğinin yeterli çalışma mesafesi sağladığından emin olun. Sahne üstü inkübatörden, cam tabanlı tabaktan ve doku kültürü ekinden eklenen yüksekliğin bir sonucu olarak, uzun çalışma mesafesi hedefleri kritik öneme sahiptir.
   6. Cam alt plakayı sabitleyin, plastik Petri kabı kapağını çıkarın ve gaz geçirgen bir zarla örtün.
2. Image Acquisition
   1. Dilimi görsel olarak incelemek için mikroskobu kullanın ve dilim kenarı ile merkez arasında yeterli floresan etiketli tümör hücresi yoğunluğuna sahip uygun bir alan bulun. Görüntüleme sırasında doku kaymalarına karşı artan duyarlılık nedeniyle dilimin kenarındaki görüntüleme alanlarından kaçının. Bu kaymayı sınırlamak için doku dilimi arpları kullanılabilir.
   2. İlk (alt) ve son (üst) Z yığını sınırlarını, görüntülenecek tüm konumların görünür bir floresan hücresel sinyal içereceği şekilde ayarlamak için çok boyutlu analiz modunda görüntüleme yazılımını kullanın. 10 μm'lik sabit bir Z adımı ile dilimin 150 - 200 μm'lik kısmı boyunca görüntüleme, hücre yollarının izlenmesi için yeterli çözünürlük sağladı (bu, bireysel görüntüleme ihtiyaçları için ayarlanabilir).
   3. Mikroskobun motorlu bir aşaması varsa, her Z-yığını alımı için yeterli zamana izin verildiğinden emin olun. Alımlar arasındaki zaman aralığını, konum başına eşit tarama süresi x görüntülenecek konum sayısı (yani, görüntülenen tümör bölgeleri) olarak ayarlayın.
      NOT: Yeşil ve kırmızı floroforların aynı anda uyarılması için, aynı anda 488 nm ve 633 nm uyarımlı çift çizgili bir lazer çizgi tarama programı kullanın. Seçilen lazer uyarımının dalga boyu, eksprese edilen bireysel floresan proteinlere göre değişecektir.
   4. Görüntülenen tümör bölgeleri arasında tek tip lazer gücü ve konfokal iğne deliği ayarlarını koruyun. Fototoksisiteyi sınırlamak için tümör hücresi gövdelerini ve süreçlerini net bir şekilde ayırmak için gereken en düşük lazer gücü ayarını kullanın. Spesifik görüntüleme parametre birimleri (yani güç ve konfokal iğne deliği ayarları) mikroskop ve lazer kaynağı özelliklerine göre değişecektir.
   5. Hedefe doğru ilerleyen odak düzlemlerine 2 - 3 "tampon" Z-yığını adımı ekleyerek potansiyel ortam buharlaşmasını telafi edin. Bu, dokunun dikey düzlemde Z-yığını edinimleri aralığından çıkmasını etkili bir şekilde önler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM Yüksek Glikoz	İnvitrojen (Gibco)	11960-044
Neurobazal-A Orta, eksi fenol kırmızısı	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 Takviyesi (50X), serum içermeyen	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)	İnvitrojen (Gibco)	15140-122
GlutaMAX Takviyesi	İnvitrojen (Gibco)	35050-061
L-Glutamin (200 mM)	İnvitrojen (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	İnvitrojen (Gibco)	15630-080
Nistatin Süspansiyon	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	DPBS'de 10.000 birim / mL, aseptik olarak işlenmiş, BioReagent, hücre kültürü için uygun
UltraPure Düşük Erime Noktalı Agaroz	Invitrogen (Gibco)	16520-050	65.5 ° C'de erir, 37 ° C'de sıvı kalır ve hızla 25 ° C'nin altına düşer.
Griffonia simplicifolia'dan İzolektin GS-IB4, Alexa Fluor 647 Konjuge	Thermo Fisher (Moleküler Problar)	I32450	Mikroglia/Makrofajları etiketlemek için medyada kullanılır
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector	Clonetech	632520
Retro-X Konsantratör	Clonetech	31455	Viral süpernatanların ultrasantrifüj olmayan konsantrasyonu için bağlayıcı reçine
pVSG-G Vektör	Clonetech	631530	Retro-X Evrensel Retroviral Ekspresyon Sisteminin bir parçası
GP2-293 Viral paketleme hücreleri	Clonetech	631530	Retro-X Evrensel Retroviral Ekspresyon Sisteminin bir parçası
Siyanoakrilat Tutkal (Süper Yapıştırıcı)	Sigma-Aldrich	Z105899	Orta viskoziteli
Peel-A-Way Gömme Kalıbı (Kare - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	Tümör örneği gömme için kalıplar
Paslanmaz Çelik Mikro Spatulalar	Fisher Scientific	S50823	Kaşık bıçağının boynunda 45 derece bükme aleti
Kavisli Fisherbrand Diseksiyon İnce Uçlu Forseps Fisher	Scientific	08-875
Tek Kenarlı Tıraş Bıçağı (Amerikan Emniyetli Tıraş Makineleri)	Fisher Scientific	17-989-001	Bıçak kenarı 0,009" kalınlığındadır. Vibratom üzerine yüklenmeden önce kıvrımlı künt kenarlı kapak çıkarılır.
Leica VT1000 S Vibratom	Leica Biosystems	VT1000 S
Hidrofilik PTFE hücre kültürü eki	EMD Millipore	PICM0RG50	30 mm, hidrofilik PTFE, 0,4 μm gözenek boyutu
35 mm Cam Alt Tabaklar	MatTek	P35G-1.5-20-C Kılıf	20mm cam çapı. Lamel cam kalınlığı 1.5
LSM 510 Konfokal Mikroskop	Zeiss	LSM 510	10x Hava Objektifi (c-Apochromat NA 0.45)
PECON Sahne Üstü İnkübatör	PeCON Almanya	(Üretimi Durduruldu)	İnkübatör PM 2000 RBT, Zeiss Mikroskopları ile kullanılmak üzere tasarlanmış uyumlu bir üründür.