Astrositlerde Kompartmana Özgü Dinamikler için Spontan Kalsiyum Görüntüleme

Özet

Kaynak: Bannai, H., et. al., Kültürlenmiş Hücrelerde Yerel Ca2+ Sinyallerinin Membran Hedefli Ca2+ Göstergeleri ile Diseksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)

Video, plazma zarı ve endoplazmik retikulum üzerinde lokalize kalsiyuma duyarlı proteinleri sırayla izleyerek astrositlerde kompartmana özgü spontan kalsiyum dinamiklerini gözlemlemek için floresan görüntülemeyi göstermektedir.

Protokol

1. Ca²⁺ Görüntüleme

1. Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f/
   />NOT: Görüntü bölme optikleri olmadan, plazma zarındaki Ca²⁺ sinyalleri ve endoplazmik retikulum (ER) etrafındaki sinyaller aynı hücrede izlenebilir. Burada, Lck-RCaMP2 (Plazma zarı hedefli genetik olarak kodlanmış Ca²⁺ göstergesi) ve OER-GCaMP6f'nin (Dış endoplazmik retikulum zarı hedefli genetik olarak kodlanmış Ca²⁺ göstergesi) aynı astrositlerde sıralı kaydı anlatılmaktadır. Spontan Ca²⁺ aktivitesi için 1.3'ten daha büyük bir sayısal açıklığa sahip bir yağa daldırma objektifi şiddetle tavsiye edilir.
   1. Kayıttan önce mikroskobu, kamerayı, ışık kaynağını ve mikroskop ısıtma odasını en az 30 dakika açın.
   2. Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f ile transfekte edilmiş hücreleri içeren lamel kayıt odasına monte edin ve 400 μL görüntüleme ortamı ekleyin. Haznenin üstüne bir kapak yerleştirin.
   3. GCaMP6f ve ışık kaynağı için filtre setini seçin (mavi uyarma ışığı, örneğin, 470– 490 nm; Malzeme Tablosuna bakın). OER-GCaMP6f'yi ifade eden astrositleri bulun.
   4. RCaMP2 için bir filtre seti ve ışık kaynağı seçin (yeşil uyarma ışığı, örneğin, 510–560 nm; Malzeme Tablosuna bakın) ve Lck-RCaMP2'nin aynı astrositlerde ifade edilip edilmediğini onaylayın. Foto ağartmayı önlemek için ışık kaynağına uzun süre maruz kalmaktan kaçının.
   5. Lck-RCaMP2'nin hızlandırılmış görüntülerini 2 dakika boyunca 2 Hz'de kaydedin. Görüntüleme verilerini HDD'ye kaydedin.
   6. Filtre ayarını GCaMP6f için olan filtreyle değiştirin. OER-GCaMP6f'nin zaman atlamalı görüntülerini aynı görüş alanında 2 Hz çözünürlükte 2 dakika boyunca kaydedin. Verileri HDD'ye kaydedin.
   7. Görüntü analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
18 mm çapında dairesel lameller	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	Kalınlık 1, 18 mm çapında dairesel lameller; alternatif lameller kullanılabilir.
Mikroskobik görüntü kaydı			Aşağıdaki kameralar kullanıma hazırdı: soğutmalı CCD kamera (örneğin, Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD kamera (örn. Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) veya CMOS kamera (örneğin, Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
Metamorph (Moleküler Cihazlar), Image J (NIH) ve TI Workbench14 (özel yapım) gibi	görüntü analiz yazılımı
Görüntüleme ortamı ve tampon			Deney için en uygun ortamı veya tamponu kullanın. Ortam kullanıldığında, arka plan floresansını azaltmak için fenol kırmızısı içermeyen ortam arzu edilir. Karbondioksit inkübatörünün dışında pH'ı korumak için 20 mM HEPES ekleyin.
IX73 (Olympus) veya Eclipse TI (Nikon Instech) gibi	ters floresan
		için mikroskop filtre seti GFP	için uygun filtre (uyarma, 480 ± 10 nm; emisyon, 530 ± 20 nm)
RCaMP2 görüntüleme			RFP için uygun filtre (uyarma, 535 ± 50 nm; emisyon, 590 nm uzun geçiş)
Mikroskop ısıtma sistemi			Görüntüleme sırasında hücreleri 37°C'de tutmak için bir ısıtma sistemi. Termal genleşmenin neden olduğu kaymayı önlemek için, tüm mikroskobun kendisini kaplayan ısıtma sistemleri (örneğin, Tokai Hit, Thermobox) önerilir.
		için mikroskop ışık kaynağı	Cıva lambası (100 W), ksenon lamba (75 W), Işık yayan diyot (LED) aydınlatma sistemi (ör. CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4 dalga boylu LED kaynağı; Lümen, SPECTRA X hafif motor). Cıva topakı ve ksenon lamba durumunda, uyarma yoğunluğunu azaltmak için ND filtresi kullanın.
Nöronlarda	ve astrositlerde spontan Ca²⁺ aktivitesinin kaydedilmesi için 1.3'ten daha yüksek sayısal açıklığa sahip mikroskop
Kayıt odası	Elveflow	Ludin Odası	Bu kayıt odası 18 mm çapında yuvarlak lameller içindir.
Stereomikroskop			Hipokampusu incelemek için kullanılır. Olympus SZ60 veya eşdeğeri stereomikroskoplar mevcuttur.

için kamera mikroskobuGCaMP6f görüntüleme için mikroskop filtre seti Uyarma objektif lensi Plan-Apochromat yağa daldırma objektifi şiddetle tavsiye edilir.