Özel MicroRNA Mikroarray deneyler gerçekleştirme

Summary

Özel microRNA mikroarray deneyler basit bir prosedür açıklanmıştır. Adımlar, RNA, etiketleme RNA ve referans DNA izole mikroarray'ler için örnekleri literatürde, mikroarray'ler tarama ve niceleme hibridizasyon sinyalleri analiz içerir.

Abstract

microRNA (miRNA'lar), yaygın olarak ^{ökaryotlarda} 1 olarak ifade edilir ~ 22 nükleotidler (nt) uzun RNA molekülleri büyük bir aileyiz . Kompleks genomların öncelikle bir çok sayıda post-transkripsiyonel hedef genlerin ^{2, 3} ekspresyonunu inhibe kullarak en az yüzlerce kodlayın. miRNA'lar biyolojik süreçlerin ¹ geniş bir kontrol eder. Buna ek olarak, değişen miRNA ifadesi, bu tür kanserleri gibi insan hastalıkları ile ilişkili olduğu ve miRNA'lar hastalıkları ^{ve prognozu 4,} 5 biyobelirteçleri olarak hizmet edebilir. Bu nedenle, ifade ve pek çok farklı koşullar altında miRNA'lar fonksiyonları anlamak önemlidir.

Real-time PCR, mikroarray ve derin sıralama: Üç büyük yaklaşımlar profil miRNA ifade istihdam edilmiştir. MiRNA mikroarray tekniği yüksek verimli olma avantajı, genellikle daha az pahalı, deney ve analiz adımları carr olabilirüniversiteler, tıp fakülteleri ve ilişkili hastaneler, bir moleküler biyoloji laboratuvarı ied. Burada, özel miRNA mikroarray deneyler için bir yöntem açıklanmaktadır. MiRNA miRNA mikroarray'ler prob seti üretmek için cam slaytlar basılacaktır. RNA küçük RNA türleri koruyan bir yöntem ya da reaktif kullanılarak izole edilmiş, ve ardından floresan bir boya ile etiketlenmiş. Kontrol olarak, miRNA'lar bir alt kümesi karşılık gelen referans DNA oligonükleotidler de farklı bir floresan boya ile işaretlenmiştir. Referans DNA slayt ve melezleşme kalitesini göstermek için hizmet verecek ve aynı zamanda veri normalleşmesi için kullanılacaktır. RNA ve DNA karışık ve veritabanı miRNA'lar en problar içeren bir mikroarray slayt melezleşmiştir. Yıkadıktan sonra, slayt görüntüler elde etmek için taranmış ve şiddetleri sayısal tek tek noktalar. Bu ham sinyalleri, ileri işlenmiş ve ilgili miRNA'lar ifade veri olarak analiz edilecektir. Microarray slaytlar microarrays maliyetini azaltmak ve tutarlılık mikroarray deneyler geliştirmek için elimden ve rejenere olabilir. Aynı usul ve esaslar özel mikroarray deneylerin diğer türleri için geçerlidir.

Protocol

1. Özel miRNA microarrays yazdırma

1. Mikroarray bir üniversite veya bir şirket mikroarray çekirdek tesisi hizmetleri kullanarak slaytlar yazdırın. Mikroarray imalat kalitesi mikroarray deneyinin başarısı için en önemli faktörlerden biridir. Mümkünse birkaç hizmetleri deneyin. İdeal olarak, bir seferde 50-100 slayt yazdırmak, ve tüm slaytları iyi ayrılmış, tek tek noktalar ile aynı bakacağız.
2. Mikroarray destek için, biz EKSİKLİK II kaplı slaytlar kullanın.
3. MiRNA probları için, NCode Multi-Türlerin Mikroarray Probe V2 Set miRNA kullanın.
4. 10 mcM 3 x SSC oligonükleotidler çözülür ve quadruply slaytları yazdırmak. GAAPS II slaytlar i....

Discussion

Mikroarray derin sıralama teknolojilerindeki son gelişmelere rağmen, DNA ve RNA yüksek verimlilik analizi için uygun bir seçenek kalır. Derin bir sıralama ile karşılaştırıldığında, mikroarray deneyler ucuzdur ve tipik bir moleküler biyoloji laboratuvarı deney ve esneklik sağlar ve zaman kazandırır veri analizi, in-house, en gerçekleştirebilirsiniz. Gelecekte, muhtemelen mikroarray'ler uygundur genler, örneğin setleri yoğun sorgulamak için, bir genom veya miRNA'lar transkripsiyon faktörlerinin tümünü ya da bir al.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Öğeler	Satıcı	Katalog numarası	Yorumlar
NCode Multi-Türlerin Mikroarray Probe Set V2 miRNA	Invitrogen	MIRMPS201	MiRBase Sürüm 9.0 (Ekim 2006) göre tasarlanmıştır. ~ Değiştirilmeden 1140, 34-44 nt uzunluğunda oligonükleotidler, solucan, sinek, zebrafish, fare, sıçan, ve insan miRNA'lar probları olarak ve iç kontrol probları gibi snoRNAs gibi bir dizi içerir. MiRNA probları dolayısıyla olgun miRNA'lar ~ 44 nt boyutu tamamlayıcı dizilerinin çiftlerin. Analizi için bir ilgi belirli bir gen (ler) den miRNA'lar odaklanmak.
Trizol	Invitrogen	15596018	Toplam RNA örnekleri hazırlamak ve ölçmek için daha hızlı ve daha kolay ve mRNA analizi gibi downstream uygulamalar için uygun olmasına rağmen Ayrıca, etiketleme için küçük RNA fraksiyonu zenginleştirmiş.
T4 RNA ligaz 1	Yeni İngiltere Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nükleik Asit Etiketleme Kiti	Invitrogen	U21660	Bu kit veya benzer ürünlerin yanı sıra deneysel RNA örnekleri ya da bir kontrol RNA (yerine kontrol DNA) etiket kullanılabilir.
5'-PCU-DY547-3 '	Dharmacon	Özel yapılmış	Küçük RNA fraksiyonu benzer ligasyonu ile etiketli olabilir.
CentriSep sütunlar	Princeton Ayrımları	CS-901
GAPSII kaplı slayt	Corning	40004	Slayt Diğer tür de kullanılıyor olabilir.
Mikroarray hibridizasyon odaları	Corning	2551 ya da 40.080	Hibridizasyon odaları ve lamelleri başka türlü de çalışması gerekir. ~ 2 saat piyasada bulunan hibridizasyon makineleri kullanma, belirgin örneğin hibridizasyon zamanı azaltabilir.
Lifterslips	ThErmo / Erie Bilimsel	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent