Hidrojel Bazlı Bir Mikro Sütun Kullanarak Mikro Doku Mühendisliğine Sahip Bir Sinir Ağı Geliştirme

Özet

Kaynak: Struzyna, L. A. et. al., Sinir Sistemi Yeniden Yapılandırması, Modülasyonu ve Modellemesi için Anatomik Olarak İlham Alan Üç Boyutlu Mikro Doku Tasarlanmış Sinir Ağları. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, hücre dışı matris çekirdeğe sahip bir hidrojel mikro sütun kullanılarak mikro doku mühendisliği yapılmış sinir ağlarının gelişimini göstermektedir. Tohumlanmış nöronal agregatlar yapışır, projeksiyonları uzatır ve yapılandırılmış sinir ağları oluşturarak nörogelişim ve nöroterapötik araştırmalardaki ilerlemelere katkıda bulunur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Agaroz Hidrojelin Geliştirilmesi (Mikro doku mühendisliği yapılmış sinir ağlarının (mikro-TENN'ler) Aselüler Bileşeni

)

1. Agaroz çözeltisi hazırlama
   1. Bir biyogüvenlik kabini içinde, iki adet 10 cm'lik Petri kabının her birine 20 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini (DPBS) aktararak mikro sütunlar için rezervuarlar hazırlayın. İnce forsepsleri ve mikro neşterleri sıcak boncuk sterilizatörü ile sterilize edin.
   2. 3 g agarozu tartın ve biyogüvenlik kabini içindeki steril bir behere aktarın. % 3 ağırlık / hacim (a / h) nihai konsantrasyon için 100 mL DPBS ekleyin. Temiz bir manyetik çubuk ekleyin ve kabı alüminyum folyo ile kaplayın.
   3. Sıcak bir plaka/karıştırıcı ile beheri 100 °C'de ısıtın ve agarozu tamamen çözmek için 120-200 rpm'de karıştırın (çözelti bulanıktan berrak hale gelecektir). Jelleşmeyi önlemek için ısıtmayı ve daha sonra karıştırmayı sürdürün ve agarozun yanmasını önlemek için ısıtma sıcaklığını gerektiği gibi değiştirin.
      NOT: Hem lazerle kesilmiş cihaz hem de kılcal borularla yapılan imalat, aşağıda sırasıyla 1.2 ve 1.3 alt bölümlerinde sunulmuştur. Her iki alt bölümde açıklanan adımları tamamladıktan sonra alt bölüm 1.4'e geçin. Her iki mikro kolon üretim yöntemi için, agaroz soğudukça hızla katılaştığından, sıvı agarozu hızlı bir şekilde ekleyin. Aşağıdaki adımlardan herhangi birinde bir otoklav ile sterilizasyon yaparken, cam eşyalara uygulanan standart koşulları kullanın.
2. Lazer kesim cihazı kullanılarak mikro kolon hazırlama
   NOT: Lazer kesim cihazı, ticari bir CO₂ lazer kesici kullanılarak şeffaf akrilikten kesilir. Lazer kesim yoluyla yapıların ve cihazların imalatı, bir dizi mühendislik ve araştırma uygulaması için iyi belgelenmiştir. Bu kalıp (Şekil 1), her biri 398 μm çapında ve 6.35 mm uzunluğunda beş silindirik kanal dizisinden oluşur. Bu silindirik diziler, uzunlukları boyunca iki parçadan oluşur: sırasıyla Şekil 1A ve 1B'de gösterildiği gibi bir alt yarısı (uzunluk: 25.4 mm, genişlik: 6.35 mm, yükseklik: 6.0 mm) ve bir üst yarısı (uzunluk: 31.5 mm, genişlik: 6.35 mm, yükseklik: 12.7 mm). İki yarı, Şekil 1C'de gözlemlenen ön ve arka kapaklarla (uzunluk: 31,5 mm, genişlik: 6,35 mm, yükseklik: 12,7 mm) birbirine kenetlenebilir, bu kapakların her biri üst ve alt parçalarda iki delikle çakışan ve vidalandığında tüm parçaları birbirine sabitlemeye yardımcı olan dört hizalama deliğine sahiptir. Bu kapaklar ayrıca, mikro sütunların lümenini oluşturmak için akupunktur iğnelerinin yerleştirilebileceği silindirik kanallara eş merkezli beş delik içerir.
   1. Şekil 1'de gösterilen cihazı alüminyum folyo ile kaplayarak ve otoklavlayarak sterilize edin. Ön ve arka kapakları sadece alt yarım parça ile hizalayarak ve üç parçayı alt hizalama deliklerine iki # 4-4 vida ve somunla (diş çapı: 40 mm) sabitleyerek cihazı Şekil 3.05D'de gösterildiği gibi monte edin.
   2. Bir akupunktur iğnesini (çap: 180 μm, uzunluk: 30 mm) cihazın ön veya arka kapağındaki iğne deliklerine tam olarak sokun (Şekil 1D). Bir mikropipet ile, silindirik kanal yarımlarının her birini tamamen doldurmak için alt yarım parçaya yeterli miktarda sıvı agaroz (beş kanal için ~ 1 mL) dökün.
   3. Cihazın üst yarısını hemen alt yarının üzerine yerleştirin ve silindirik kanalları tamamlamak için sıkıca yerine oturana kadar basınç uygulayın (kapaklar ile üst parça arasındaki sürtünme, ikincisini yerinde tutacaktır). Cihazın kanalları içinde jelleşmesine izin vermek için agaroz ilavesinden sonra oda sıcaklığında ~ 5 dakika bekleyin.
   4. İğneyi, cihazın kapaklarındaki deliklerin her birinden manuel olarak çıkarın. Vidaları sökün ve iki kapağı ve üst yarıyı, hidrojel mikro sütunları tutacağı alt yarım parçadan manuel olarak ayırın.
   5. Mikro sütunları alt yarım parçadaki kanallardan nazikçe çıkarmak için ince forseps kullanın ve bunları DPBS içeren önceden hazırlanmış Petri kabına yerleştirin (adım 1.1.1). Cihazı başka bir mikro kolon imalatı turu için yeniden kullanın. Alt bölüm 1.4'e ilerleyin.
3. Kılcal borular kullanılarak mikro sütun imalatı
   1. Cam kılcal boruları (çap: 398.78 μm, uzunluk: 32 mm) biyogüvenlik kabininin içine aktarın. Uzun tüpleri manuel olarak 2,0-2,5 cm'lik parçalara ayırın ve her parçaya bir akupunktur iğnesini (çap: 180 μm, uzunluk: 30 mm) tam olarak yerleştirin (Şekil 2A).
   2. Beherden 1 mL sıvı agarozu boş bir Petri kabının yüzeyine aktarın. Kılcal boruyu ve sokulan iğneyi tutarak, kılcal hareketle doldurmak için tüpün bir ucunu sıvı agaroz havuzuna temas edecek şekilde yerleştirin. Kılcal yükselmeyi teşvik etmek için tüpü çalkalayın.
      NOT: Kılcal tüpleri, kılcal hareketin izin verdiği kadar yüksek sıvı agaroz ile doldurun; Daha sonra, bu mikro sütunlar istenen uzunluğa bağlı olarak daha küçük yapılar halinde kesilebilir. 1 mL agaroz havuzu tipik olarak sadece bir tüp için kullanılır, çünkü agaroz hızla soğur ve jelleşir, bu da daha fazla kılcal hareketi önler.
   3. Sıvının yükselmesi durduğunda, kılcal boruyu havuzdan çıkarın ve bir Petri kabının yüzeyine yatay olarak yerleştirin. Agaroz jelin tüplerin içine yerleşmesi için 5 dakika bekleyin.
   4. Başparmağınızı ve işaret parmağınızı tüpün her iki tarafına yerleştirin ve ona doğru bastırın. Mikro kolonun kendisinin tüpten dışarı kaymasını önlemek için başparmak ve işaret parmağını kullanırken iğneyi hızlı bir şekilde dışarı çekmek için diğer elinizi kullanın. Mikro sütunu DPBS içeren bir kabın içine yavaşça itmek için kılcal boruya 30 gauge bir iğne sokun (adım 1.1.1).
4. Mikro sütun kırpma ve sterilizasyon
   1. İnce forseps kullanarak bir mikro sütunu DPBS'den boş bir tabağa hassas bir şekilde aktarın. Kurumayı önlemek için mikro kolonun üstüne bir mikropipet ile 10 μL DBPS ekleyin. İkinci tabağı görsel rehberlik için bir stereoskopun altına yerleştirin.
      NOT: Protokol boyunca, mikro kolon kurutma veya dehidrasyon, bu yapıların tipik, hidratlı görünümünden görsel olarak ayırt edilebilen buruşuk bir yapının elde edilmesini ifade eder. Susuz mikro sütunlar, Petri kaplarının yüzeyine sıkıca yapışır ve kolayca hareket ettirilemezken, hidratlı yapılar forseps ile manipüle edildikten sonra yüzey boyunca kayma eğilimindedir. Tamamen kurumuş bir mikro kolonun faz kontrast görüntüsü Şekil 3A'da gösterilmiştir.
   2. İstenilen uzunluğa kısaltmak için mikro sütunu bir mikro neşterle kesin (burada 2-5 mm). Kesilmiş mikro sütunu ince forseps ile adım 1.1.1'de hazırlanan diğer DPBS Petri kabına taşıyın.
   3. Üretilen her mikro sütun için 1.4.1 ve 1.4.2 adımlarını tekrarlayın.
   4. DPBS içeren Petri kaplarındaki mikro kolonları ultraviyole (UV) ışık altında 1 saat sterilize edin. Petri kaplarını hücre dışı matris (ECM) ilavesi ve hücre kaplamasından önce 4 °C'de saklayın.

2. Birincil Nöron Kültürü ve Zorlanmış Hücre Agregasyon

1. Yöntemi Piramidal mikro kuyu dizisinin hazırlanması
   NOT: Bu bölüm, Şekil 1E'de gösterildiği gibi 3 x 3 dizide düzenlenmiş, silindirik bir tabandan (çap: 2,2 cm, yükseklik: 7,0 mm) ve üstte dokuz kare piramitten (yan uzunluk: 4,0 mm, eğim açısı: 60°) oluşan 3D baskılı bir kalıp kullanır. Ticari olarak temin edilebilen 3D yazıcıları kullanan eklemeli üretim süreci iyi belgelenmiştir. Kalıbı tasarlamak için bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanılabilir. Elde edilen tasarım dosyası daha sonra dijital olarak bir 3D yazıcı için bir takım yoluna dönüştürülebilir. Her yazıcının farklı özellikleri vardır ve bir 3D yazıcıyı kurma ve çalıştırma talimatları buna göre değişir.
   1. 10 cm'lik bir Petri kabının kapağında ortalanmış 4 x 4'lük bir dizide (kenar uzunluğu: 4 cm, delik ayrımı: 1 cm) 16 delik açmak için 3/32" matkap ucu kullanın. Kimyasal bir çeker ocak içinde, 27 g polidimetilsiloksan (PDMS) ve 3 g kürleme maddesi (1:10 oranı için) tartmak için Petri kabının alt parçasını kullanın. Ajanı eşit şekilde dağıtmak için bir mikro spatula ile karıştırın.
   2. PDMS/sertleştirici maddeyi delinmiş kapakla kapatın. Bir hortumun bir ucunu çeker ocakın vakum portuna bağlayın ve diğer ucunu bir huninin gövdesine yerleştirin (ağız çapı: 10 cm, gövde uzunluğu: 3 cm, gövde çapı: 1.5 cm).
   3. 1 mL pipet ampulünün üst kısmında 3/32" matkap ucuyla bir delik açın ve 1.000 μL'lik bir mikropipet ucunu açıklığa yerleştirin ve sabitleyin (sivri ucu yukarı bakacak şekilde). Ampulü ve ucu hortumun içine yerleştirin ve ampul hortumu huninin gövdesine sızdırmaz hale getirene kadar hortumu yukarı doğru çekin.
   4. Huniyi delinmiş çanak kapağına yerleştirin ve hortumu mevcut sağlam bir destekle sabitleyin. Emme için vakum valfini 5 dakika açın ve hava kabarcıklarını yüzeye çıkarın.
   5. Valfi kapatın, huniyi çıkarın ve kalan hava kabarcıklarını patlatmak için Petri kabını çeker ocak yüzeyine ~3 kez vurun.
   6. Piramitler yukarı bakacak şekilde 12 oyuklu bir kültür plakasındaki kuyucukların her birine piramidal kuyucuklu 3D baskılı bir kalıp yerleştirin. Plakanın her bir kuyucuğu dolana kadar PDMS/kürleme maddesini kalıpların üzerine dökün. 12 oyuklu plakayı kapağıyla kapatın ve kuruması için 60 °C'de 1 saat fırına aktarın.
   7. Her bir PDMS mikro kuyu dizisini (Şekil 1F) bir mikro spatula ile plakadan dikkatlice çıkarın. PDMS dizilerini alüminyum folyo ile örtün ve otoklavlayarak sterilize edin. Bir biyogüvenlik kabininin içinde, 12 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna bir mikro kuyu dizisi yerleştirin (Şekil 2B).
2. sıçan fetüslerinden kortikal nöron izolasyonu
   1. Bir biyogüvenlik kabini içindeki dört ila altı adet 10 cm'lik Petri kabının her birine (her diseke doku için bir tane) ~ 20 mL Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ekleyin. Bu bulaşıkları bir diseksiyon başlığına aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Mikro neşter, makas ve forseps gibi diseksiyon aletlerini sıcak boncuk sterilizatörü ile sterilize edin.
   2. Ön ısıtmalı embriyonik nöron bazal ortamı +% 2 serumsuz takviye + 0.4 mM L-glutamin (bundan sonra "kültür ortamı" olarak anılacaktır) ve% 0.25 tripsin + 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 37 ° C'de. Deoksiribonükleaz (DNaz) I'i oda sıcaklığına koyarak çözün. HBSS'de 1.5 mL 0.15 mg / mL DNAse I çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi buz üzerinde tutun.
   3. Zamanlanmış hamile bir embriyonik gün-18 sıçanı karbondioksit inhalasyonu ile ötenazi yapın ve dekapitasyon ile ölümü onaylayın. Karkası steril bir diseksiyon başlığına aktarın ve ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yatırın. Karnı% 70 etanol ile iyice durulayın.
   4. Uterusu açın ve fetüsleri (genellikle ~ 11) amniyotik keselerden makasla çıkarın ve tarif edildiği gibi forseps ile soğuk HBSS içeren bir Petri kabına aktarın. Stereoskopun altına soğutulmuş (-20 °C) bir granit blok yerleştirin. Diseksiyon prosedürü boyunca HBSS'nin düşük sıcaklığını korumak için Petri kabını bu soğuk bloğun yüzeyine yerleştirin.
   5. HBSS'yi çevirerek yavruları durulayın ve ardından HBSS içeren bir sonraki temiz kaba aktarın. Stereoskop ve diseksiyon aletlerinin yardımıyla, fetüslerin başlarını, serebral hemisferlerini ve kortekslerini sırayla çıkarın ve her diseksiyondan sonra forseps ile her dokuyu yeni bir HBSS dolu kaba aktarın.
   6. Pasteur pipeti ile sadece korteksleri aspire edin ve dokuyu steril 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Diğer disseke edilmiş dokuları atın. Serolojik bir pipet ile ~ 5 mL HBSS'yi sırayla ekleyip çıkararak korteksleri üç kez durulayın. Kullanılmadığı zaman tüpü buzun üzerine yerleştirin.
   7. Korteksleri bir Pasteur pipeti ile önceden ısıtılmış tripsin-EDTA (5 mL tripsin-EDTA başına 4-6 korteks) içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Tüpü bir kez manuel olarak çalkalayın ve 37 °C'ye yerleştirin. Dokunun topaklanmasını önlemek için tüpü her 3 dakikada bir ters çevirin.
   8. Dokuyu bir Pasteur pipeti ile çıkararak ve temiz bir 15 mL santrifüj tüpüne aktararak ~ 10 dakika sonra tripsine maruz kalmayı durdurun. 0.15 mg / mL DNaz I çözeltisini (1.5 mL) bir pipet ile tüpe ekleyin.
   9. Doku kümelerini manuel olarak parçalamak için bir Pasteur pipeti kullanın ve ardından çözelti homojen görünene ve sıvıda kalan doku parçası kalmayana kadar girdap (~ 30 s) kullanın. Çözeltiyi tamamen homojenize etmek mümkün değilse, çözünmeyen parçaları bir Pasteur pipetinin ucuna çekerek çıkarın.
   10. Adım 2.2.9'da elde edilen homojen hücre çözeltisini 200 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Peletlenmiş hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatantı bir Pasteur pipeti ile çıkarın. Hücreleri yeniden süspanse etmek için serolojik bir pipet ve girdap ile 2 mL kültür ortamı ekleyin.
   11. Bir hemositometre kullanarak adım 2.2.10'da hazırlanan çözeltideki hücre sayısını sayın; beklenen verim 3.0-5.0 x 10⁶ hücre / kortikal hemisferdir. Kültür ortamında 1.0-2.0 x 10⁶ hücre / mL yoğunluğa sahip 1 mL veya daha fazla hücre süspansiyonu hazırlayın.
3. Nöronal hücre agregatlarının oluşumu
   1. Bir mikropipet ile, PDMS dizisinin her bir mikro kuyucuğuna (adım 2.1.7'de plakaya yerleştirilen) 12 μL 1.0-2.0 x 10⁶/mL hücre süspansiyonu ekleyin.
      NOT: Hücre konsantrasyonu, mikro kolon iç çapına ve istenen hücre agrega boyutuna bağlı olarak ayarlanabilir, daha yüksek konsantrasyonlar daha büyük agregalar verir.
   2. Mikro kuyucukların dibindeki hücrelerin toplanmasını zorlamak için plakayı 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin (Şekil 2B). Toplanmış hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek, tüm tohumlanmış mikro kuyucukları kaplamak için her bir PDMS dizisinin üstüne dikkatlice ~ 2 mL kültür ortamı ekleyin.
   3. Plakayı 37 ° C ve% 5 CO_2'de 12-24 saat inkübe edin.

3. Mikro-TENN'lerin Hücresel Bileşeninin Geliştirilmesi

1. ECM çekirdek üretimi
   1. Agrega inkübasyonundan sonra, ECM çözeltisini hazırlamak için bir mikrosantrifüj tüpünde kültür ortamına (her biri 1 mg / mL'lik bir konsantrasyon için) tip I kollajen ve laminin ekleyin. 3.1.2-3.1.4 adımlarını oda sıcaklığında gerçekleştirin, ancak erken jelleşmeyi önlemek için kullanılmadığında ECM'li tüpü buz üzerinde tutun.
      NOT: Tipik harcama, her mikro kolon için 4 μL ECM çözeltisidir (uzunluk: 5 mm, ID: 180 μm).
   2. İlk pH'ı doğrulamak için turnusol kağıdına 1-2 μL aktararak, ECM'ye gerektiği gibi 1 μL 1 N sodyum hidroksit (NaOH) ve/veya 1 N hidroklorik asit (HCl) ekleyerek ve pH 7,2-7,4 olana kadar tekrarlayarak ECM çözeltisinin pH'ını ayarlayın. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlerken yukarı ve aşağı pipetleme yaparak ECM çözeltisinin homojenizasyonunu sağlayın.
   3. Sterilize edilmiş forsepsli mikro kolonları adım 1.4.3'teki bulaşıklardan 35 veya 60 mm'lik boş Petri kaplarına aktarın. Dehidrasyonu önlemek için bir seferde 4-5 mikro sütun üzerinde çalışın. 10 μL'lik bir ucu 1.000 μL'lik bir uca bir mikropipete takın. Görsel rehberlik için stereoskopu kullanarak, ucu mikro sütunların bir ucuna yerleştirin ve lümenden kalan DPBS'yi ve hava kabarcıklarını çıkarmak için emdirin.
   4. Bir mikropipette hızlı bir şekilde 4-5 μL ECM çekin. Bir stereoskop altında gözlem yaparak, mikropipetin ucunu mikro sütunların uçlarından birine yerleştirin ve lümeni doldurmaya yetecek kadar ECM'yi boşaltın. Lümende hava kabarcıklarının olmadığını onaylayın, çünkü bunlar ECM yoluyla aksonal büyümeyi engelleyebilir. Hava kabarcıkları varsa, adım 3.1.3'te açıklandığı gibi ECM'yi çıkarın ve ECM'yi tekrar ekleyin.
   5. Dehidrasyonu önlemek için, her mikro sütunun etrafına ~ 2 μL ECM ekleyin. Petri kaplarındaki hidrojel/ECM mikro kolonlarını 37 °C ve %5_CO2'de 25 dakika inkübe edin. İnkübasyondan hemen sonra hücre tohumlamaya devam edin.
      NOT: Adım 3.1.5'teki inkübasyon süresinin, mikro kolonların içindeki kollajen ve lamininin polimerizasyonu için zaman tanıması amaçlanmıştır.
2. Mikro sütunlarda nöronal hücre tohumlaması
   NOT: Dönüştürülen agregaların kültür ortamını değiştirmek için, plakayı eğin, kuyu duvarında biriken ortamı çıkarmak için bir mikropipet kullanın ve ardından duvara yavaşça ~ 1 mL ekleyin (piramidal mikro kuyucuklardaki agregaları rahatsız etmemek için). Bu orta değişikliği ikinci kez tekrarlayın.
   1. Adım 3.1.5'teki inkübasyon dönemini takiben, yaklaşık 10-20 μL kültür ortamını mikro sütunları tutan Petri kaplarındaki iki boş alana aktarın. Agregaları, yapıları içeren Petri kabına ayrı ayrı aktarmak için bir mikropipet kullanın ve hücre sağlığını korumak için forseps ile küçük kültür ortamı havuzlarından birine taşıyın.
   2. Bir stereoskop altında gözlem yaparken, çift yönlü mikro TENN'ler için mikro sütunların her iki ucuna veya forseps kullanarak tek yönlü bir mimari için (istenildiği gibi) bir ucuna bir agrega yerleştirin. Stereoskopu kullanarak agregaların mikro sütunların içine yerleştirildiğini onaylayın. Dehidrasyonu önlemek ve agrega sağlığını korumak için tohumlanmış mikro sütunları diğer küçük kültür ortamı havuzuna taşımak için forseps kullanın.
   3. Agregaların ECM'ye yapışmasını sağlamak için 37 °C ve %5 CO_2'de 45 dakika inkübe edin. Stereoskopu kullanarak agregaların mikro sütunların uçlarında kaldığını doğrulayın; Hücre agregalarını yeniden ekleyin ve inkübasyon adımını gerektiği kadar tekrarlayın.
   4. Mikro-TENN'leri içeren Petri kaplarını serolojik bir pipet kullanarak kültür ortamıyla (sırasıyla 35 veya 60 mm'lik bir Petri kabı için 3 veya 6 mL) dikkatlice doldurun. Uzun süreli kültür için bulaşıkları 37 °C ve% 5 CO_2'de bir inkübatöre koyun.
   5. Kültür ortamı ile her 2 günde bir yarım ortam değişiklikleri yapın. Eski ortamın yarısını bir pipetle dikkatlice çıkarın ve mikro TENN'lerin emilmesini önlemek için görsel rehberlik için stereoskopu kullanın. Bir pipetle yavaşça taze, önceden ısıtılmış ortam ekleyerek değiştirin.

Sonuçlar

Şekil 1: Hücre agregasyonu için lazerle kesilmiş mikro kolon üretim cihazının ve 3D baskılı piramidal mikro kuyu kalıbının planları. (A)-(B) Hidrojel mikro sütunları imal etmek için kullanılan silindirik kanal dizisinin sırasıyla alt ve üst yarılarının pl...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Lazer kesici	Üniversal lazer sistemleri	PLS4.75	Lazer kesim mikro kanal kalıbını imal etmek için kullanılır.
Lazer kesim mikro kolon imalat cihazı	Ismarlama	--------------	İlgileniyorsanız araştırma grubumuzla iletişime geçin. El yazmasında sağlanan boyutlar ve planlar.
Vidalar	--------------	--------------	#40, diş çapı 3,05 mm
Somunlar	--------------	--------------	#40, diş çapı 3,05 mm
olan Akupunktur iğnesi (180 μm çap)	Lhasa medikal	sj.16X40	Çap, mikro kolon lümeni için istenen boyuta göre değiştirilebilir.
Petri kabı	Fisher	08772B
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polistiren tek kullanımlık serolojik pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Kılcal tüp (398 μm çap)	Fisher	21170D	Çap, mikro kolon kabuğu için istenen boyuta göre değiştirilebilir.
Sıcak plaka	Fisher	SP88857200
Manyetik çubuk	Fisher	1451352
Mikropipet	Sigma	Z683884-1EA
25 mm ölçer iğne	Fisher	14-826-49
Mikro Neşter	Roboz cerrahi	RS-6270
Makas	Güzel bilim araçları	14081-09
Forseps	Dünyası hassas aletler	501985
Sıcak boncuk sterilizatörü	Sigma	Z378550-1EA
Stereoskop	Nikon	SMZ800N	Tüm diseksiyon adımları ve mikro-TENN üretimi için kullanılır.
Sıçan kuyruğu tip I kollajen	Corning	354236	4 ºC'de koruyun ve sadece gerektiğinde çıkarın. Kullanım sırasında sıcaklığını korumak için buz kullanın.
Mikrosantrifüj tüpü	Fisher	02-681-256
Fare laminin	Corning	354232	4 ºC'de muhafaza edin ve sadece gerektiğinde çıkarın. Kullanım sırasında sıcaklığını korumak için buz kullanın.
Nörobazal ortam	Invitrogen	21103049	Doğum öncesi ve embriyonik nöronal hücrelerin kültürü için bazal ortam. Kullanmadan önce 4ºC'de saklayın ve 37 ºC'de ısıtın.
Sodyum hidroksit (NaOH)	Fisher	SS2661
Hidroklorik asit (HCl)	Fisher	SA48-1
Turnusol kağıdı	Fisher	09-876-18
Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS)	İnvitrojen		14170112 4 ºC'de saklayın.
% 0.25 Tripsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Kullanmadan önce -20 ºC'de saklayın ve 37 ºC'de ısıtın.
Sığır pankreatik deoksiribonükleaz (DNaz) I	Sigma	10104159001	Kullanmadan önce -20 ºC'de saklayın ve 37 ºC'de ısıtın.
B-27 Takviyesi	İnvitrojen	12587010	Hipokampal ve kortikal nöronların kültürü için nörobazal ortama eklenen takviye. Kullanmadan önce -20 ºC'de saklayın ve 37 ºC'de ısıtın.
L-glutamin	Invitrogen	35050061	Kullanmadan önce -20 ºC'de saklayın ve 37 ºC'de ısıtın.
Sprague Dawley embriyonik gün 18 sıçanlar	Charles River	Strain 001
Pasteur pipet	Fisher	22-042816
15 mL santrifüj tüpü	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Santrifüj	Fisher	05-413-115
Hemositometre	Fisher	02-671-6
Objet30 3D Yazıcı	Stratasys	--------------	Piramidal mikro kuyu kalıplarını imal etmek için kullanılır.
3D baskılı piramidal kuyu kalıbı	Ismarlama	--------------	İlgileniyorsanız araştırma grubumuzla iletişime geçin. El yazmasında sağlanan boyutlar ve planlar.
Polidimetilsiloksan (PDMS) ve sertleştirici	Fisher	NC9285739	Elastomer ve kürleme maddesi içeren kit olarak gelir. Kimyasal davlumbazın içinde kullanın.
Huni	Fisher	10-348C
1 ml pipet ampulü	Sigma	Z509035
Mikro spatula	Fisher	S50821
12 oyuklu kültür plakası	EMESCO	1194-353043
Fırın	Fisher	11-475-154
Kuluçka	Balıkçısı	13 998 076
Eclipse Ti-S Mikroskop	Nikon	--------------	Faz kontrastlı görüntülerin alınması için kullanılır. Nikon elements temel araştırma yazılımı (4.10.01) ile arabirim içeren bir QiClick kamera kullanılarak dijital görüntü elde etme ile.