Sitokrom kullanarak Mitokondriyal Solunum Fonksiyon Görselleştirme C Oksidaz / Succinat Dehidrogenaz (COX / SDH) Çift-etiketleme Histokimya

Summary

Sitokrom c oksidaz / sodyum dehidrogenaz (COX / SDH) çift etiketleme yöntemi, doğrudan bir görünüm için taze dondurulmuş doku kesitlerinde mitokondriyal solunum enzim eksiklikleri sağlar. Bu basit bir histokimyasal teknik ve mitokondriyal hastalıklar, yaşlanma, yaşlanma ile ilişkili bozukluklar araştıran yararlıdır.

Abstract

Mitokondriyal DNA (mtDNA) kusurlar, önemli bir hastalık nedenidir ve ^{değişiklikler} 1,2 yaşlanmaya ve yaşlanma ile ilgili temelini olabilir . Mitokondriyal teorisi yaşlanma, yaşlanma ^süreci 3, biyoenerjetik homeostazı ve hücresel fonksiyon değiştirebilir mtDNA mutasyonlarının için bir rol göstermektedir . Kanıtların bir servet bu teori ^{1,4, 5} mtDNA Mutator fare bir örnek destek derlenmiştir, ancak, yaşlanma mtDNA hasarı kesin rolü ^6,7 tamamen anlaşılmış değildir.

Solunum enzimleri aktivite Gözlem mitokondriyal disfonksiyonu araştırmak için basit bir yaklaşımdır. Kompleks IV veya sitokrom c oksidaz (COX), mitokondriyal fonksiyon için çok önemlidir. COX katalitik alt birimden mtDNA tarafından kodlanan ve karmaşık montaj (Şekil 1) için gereklidir. Böylece, doğru sentezi ve işlevi büyük ölçüde mtDNA ^{bütünlüğünü} 2 dayanmaktadır .Konusu olsa da, diğer solunum yolu kompleksleri incelenmiştir Kompleksleri IV ve II histokimyasal inceleme ^8,9 için en müsait. Kompleks II veya süksinat dehidrogenaz (SDH), mitokondriyal biyogenezi ^10-12 bir artış gösteriyor olabilir rağmen, tamamen nükleer DNA (Şekil 1) tarafından kodlanır ve faaliyet genellikle etkilenen engelli mtDNA değildir. Engelli mtDNA yaşlanma, mitokondriyal hastalıklarda gözlenen ve yaşla ilişkili hastalıklar genellikle, düşük ya da hiç COX ^aktivitesi 2,12-14 hücrelerin varlığı yol açar . COX ve SDH faaliyetleri ayrı ayrı incelenmiştir olmasına ^rağmen, 15,16 ardışık çift etiketleme ^yöntemi, 12,17-21 mitokondriyal disfonksiyon hücrelerin yerini avantajlı olduğu kanıtlanmıştır.

Testin en uygun anayasaların çoğu substrat konsantrasyonu, elektron alıcısı / donörler, ara elektron taşıyıcıları, pH etkisi, ve reaksiyon t gibi tespit edilmiştirime ^9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidin (DAB), etkili ve güvenilir bir elektron ^donörü 22 . , Kahverengi indamine polimer ürünü işleyen COX hücrelerinde mitokondriyal cristae yerelleştirme ve hücreler ²² doyurabilecek. Bu nedenle, işlevsiz COX ile bu hücrelerin mavi formazan ^son ürün 9,24 nitroblue tetrazolium (NBT), bir elektron alıcısı azaltılması SDH aktivite görselleştirme için izin DAB ürün doymuş olmaz. Sitokrom c ve sodyum süksinat substratlar kontrolü ve mutant / hastalıklı dokuların ⁹ arasında endojen düzeylerini normalleştirmek için eklenir. Katalaz peroksidaz aktivitesini ^9,22 mümkün kirlenmesine neden olan reaksiyonları önlemek için bir önlem olarak eklenir. Phenazine methosulfate (PMS), bir ara elektron taşıyıcı, son reaksiyon ürünlerinin ^9,25 oluşumunu arttırmak için sodyum azid, bir solunum zinciri inhibitörü ile birlikte kullanılır. Bu bilgilendirmek rağmenation, bu yakışık alır basit bir testin sonucu etkileyen bazı kritik detayları, özgüllük kontrolleri ve tekniği gelişmeler yanı sıra, henüz sunulmuş değil.

Protocol

1. Cryosectioning için doku hazırlanması

1. Mevcut etik izni ile uygun olarak, servikal dislokasyon ya da baş kesme ya da hayvan kurban.
2. Ilgi hızla dokuları (örn. Beyin) toplamak ve kuru buz (dokuların en iyi morfoloji elde etmek için sıvı nitrojen ile soğutulmuş isopentane veya propan donma gerekebilir) hızla dondurmak . -80 Alüminyum folyo Mağaza dokuların bölümüne ° C 'ye kadar hazır.
3. Cryosectioning hazırlık dondurulmuş doku gömme.
4. -21 14 mikron Kriyostat bölümleri toplayın ° C (sıcaklığını ayarlamak gerekebilir ± 1-2 ° C). Kullanıma hazır olana kadar -20 ° C'de coverslipping olmadan ısıtma bloğu, ve mağaza slaytlar k....

Discussion

Kombine COX / SDH histokimyasal yöntemi mitokondriyal disfonksiyonu olan hücrelerin görselleştirme sağlar. Bu teknik, erken çalışmalar 1968 yılına kadar uzanan, birçok hasta ^14,19,26,27 mitokondriyal hastalıkların belirlenmesi için "altın standart" dikkate alınarak, popüler olmaya devam etmektedir. Şimdi, mtDNA mutasyonu odaklı yaşlanmaya ve yaşlanma ile ilişkili ^bozukluklar 12,13,18,20,21,24 araştırmak için sık sık kullanılır. COX / SDH çift etiketleme yöntemi, genellikle belirli mtDNA m.......

Materials

Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Donmuş karbondioksit	AGA Gaz AB	blok biçimiyle
Isopentane (2 methylbutane)	Sigma-Aldrich	277258 CAS: 78-78-4
Cyrostat gömme çözümü	Sakura Finetek	Doku Tek 4583
Kriyostat	Microm	Microm Model HM 500M
Slaytlar	Thermo Scientific	Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ
Kapak gözlük Borosilikat cam	VWR Uluslararası	16004-098	24 x 50 mm
Filtre Kağıdı	Munktell Filtre AB	Kalite: 1350 MakaleSayı: 242 001	430 x 430 mm
3,3 '-diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB)	Sigma-Aldrich	Sigma Sıvı Yüzey Sistemi, D7304
Sitokrom c (Tip III, kalp at)	Sigma-Aldrich	C2506 CAS: 9007-43-6
Katalaz Sığır (karaciğer)	Sigma-Aldrich	C9322 CAS: 9001-05-2
Nitroblue tetrazolium (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876 CAS: 298-83-9
Sodyum süksinat	Sigma-Aldrich	S2378 CAS: 6106-21-4
Phenazine methosulfate (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625 CAS: 299-11-6	PMS ışığa duyarlı. Işıktan koruyun.
Sodyum azid	Sigma-Aldrich	S8032 CAS: 26628-22-8
Ksilen	VWR Uluslararası	EM-XX0060-4
Entellan	VWR Uluslararası	100503-870
Malonat (Asit malonik)	Sigma-Aldrich	M1296 CAS: 141-82-2