$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Flöresein dekstran ve GSL I-isolectin B 4 yüz ven enjeksiyonlar embriyonik damar etiketlemek için etiketlenmiş
- Fosfat içinde FITC-dekstran (50ug/mL) hazırlayın Tamponlu Tuz (PBS) veya GSL 1 - isolectin B, bir 1,5 mL Eppendorf tüpü içinde PBS içinde 4 (20ug/200uL) ve 37 ° C'de sıcak Yeşil / PBS GSL 1. Yeşil / PBS FITC-Dekstran solüsyonunun (toplam hacmi 1 ml) ve stok 1.25mm Fast 180uL stok 1.25mm Fast 100ul Ekle - isolectin çözümdür böylece B 4 (toplam hacim 200ul), gözle görülür mavi.
- Allantoik sapı (umblikal arter ve ven) zedelemeden, birlikte E14.5-E18.5 embriyo ve yolk kesesi teşrih.
- Yeni bir Petrie tabak (60 X 15 mm) kadar embriyo transferi ve oda sıcaklığında PBS içinde sokmaktan.
- Baş / yüzün sagittal bir görünüm sağlamak için embriyo yerleştirin. Yavaşça başında embriyo kavramak için mikro diseksiyon forseps kullanın.
- Bir 30G iğne kullanarak, 50uL FITC-dekstran (50ug/mL) veya GSL enjekte1 - isolectin başın arkasına doğru iğne işaret fasiyal vene B 4 (200ul PBS 20ug).
- Boya umbilikal ven görünür olduğunda, iğne kaldırmak ve allantoik sapı (umbilikal arter ve ven) gelen embriyo ayırın.
- Enjeksiyonu takiben, embriyo boya dolaşır embriyo böylece 2-3 dakika için oda sıcaklığında PBS içinde kalmasını sağlamaktadır.
2. Deri vaskülatürü Tüm montaj analizi
- Boya embriyo boyunca dolaşmaya izin verdikten sonra, sırt, bacakların bölgelerinden alınan deri örnekleri kaldırmak ve mide, vb 8,9.
- Soğuk PBS içinde deri örneği yıkayın ve 2 saat 8,9 için% 4 PFA / PBS düzeltin. 10 dakika 2mL soğuk PBS ile 4 mL berrak flakonda her biri için 3 kere yıkayın.
- Bir mikroskop yerleştirin deri örneği her slayt ve kapak cam montaj medya 100 ul kaydırın ve ekleyin.
- Slaytlar karanlık bir depolama alanında kurumasını bekleyin.
- P2 'Image Acquisition' bölümüne Adım roceed.
3. Timus ve kalp damar ve cryosections için perivasküler hücrelerin Çok renkli etiketleme (Bölüm 1, Adım 7 Devam)
- Sıvı azot 'Flaş don' bütün embriyo. Embriyolar olması ve -80 ° C'de analize kadar saklanır olabilir.
- Alternatif olarak, timus dışarı incelemek 4 ° C'de PBS ile yıkanır ve 2 saat boyunca 2mL% 4 paraformaldehit (PFA) / PBS içinde çözmek. -80 Kullanıma kadar soğuk PBS, OCT yer thymi ve dondurma ve mağaza ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın ° C
- Cryosectioning için bir bölüm 'blok' üzerinde Ekim yaymak ve kesit için embriyo veya disseke organ / dokuların monte.
- 10 mikron kalınlığında kesitler halinde dondurulmuş doku Kes ve slaytlar üzerinde toplamak.
- 5-10 dakika aseton bölümler düzeltildi. Soğuk TBS içinde 3 kere yıkayın.
- Oda sıcaklığında bir nem odası içinde% 10 eşek serum / TBS içinde engelleme.
- Primer 100 ul ile 1 saatlik gecede için bölümler inkübe4 bir nem odası antikorlar ° C: Bu örnekte, biz etiket endotele Sıçan anti-fare CD31 (1:100) ve keçi anti-fare perivasküler hücreler etiketlemek için PDGFR-β (1:100) kullanın. Bu antikor düzgün bölümüne yayılmış olduğundan emin olmak için ayrı ayrı kesilmiş Parafilm şeritler ile slaytlar karşılamak için yararlıdır.
- Primer antikor ile inkübasyondan sonra, soğuk TBS bölümler 3 kere yıkayın. En az 30 dakika için uygun sekonder antikor 100 ul ile inkübe edin.
- Soğuk TBS içinde 3 kere yıkayın. Her slayt ve kapak cam montaj medya 100 ul ekleyin.
- Slaytlar karanlık bir depolama alanında kurumasını bekleyin.
- 'Image Acquisition' bölümüne geçin.
4. Timus ve damarsal vibratome bölümleri için perivasküler hücrelerin Çok renkli etiketleme (Bölüm 1, Adım 7 Devam)
- Embriyodan timus lobları dışarı inceleyin ve soğuk PBS içinde yıkayın.
- 2 saat için oda sıcaklığında% 4 PFA / PBS içinde timus saptamaks.
- PBS-Triton X (0.15%) 3 kez, 10 dakika ve erime düşük 4% küçük bir plastik kartuş ve batığın yerini thymi yıkayın agaroz / PBS (~ 4 ° C). Timus kartuşun dibi ile temas halinde olmalıdır.
- Agaroz buz (3-5 dakika) katılaşmaya bırakın. Aşırı agaroz kesmek için jilet kullanın. Vibratome blok tutkal ekleyin ve blok numune uygun.
- Örnek ve bıçak batırılır kadar vibratome su banyosuna soğuk PBS ekleyin.
- Hız ve genlik (yüksek genlikli ve düşük-orta hızda yumuşak timus bölümleri için idealdir) ayarlayın. Bölümlerde aşırı ajitasyon nedeniyle break up genliği azaltılmalıdır.
- 50 um bölümleri kesiniz.
- Bir fırça kullanarak, soğuk PBS içinde 24-kuyu mikroplak bölümler toplamak.
- 30 dakika boyunca PBS-Triton X (% 0.15) içinde% 10 eşek serum ve 500 ul içinde blok bölümleri.
- Bu tür anti-CD31 ve anti-PDGFR-β gibi birincil antikor ile bir gece 8 saat için bölümler için, inkübe, Kapalı bir 24-çukurlu bir mikrolevhadaki.
- 4 ° C'de 8 saatlik bir toplam boyunca PBS-Triton X (% 0.15) içinde 3 kere yıkayın
- 30 dakika boyunca PBS-Triton X (% 0.15) içinde% 10 eşek serum içinde blok bölümleri.
- 8 saat bölümler inkübe 4 gecede ° C uygun ikincil antikor ile.
- 4 ° C'de 8 saatlik bir toplam boyunca PBS-Triton X (% 0.15) içinde 3 kere yıkayın
- Re-fix örneklerinde% 4 PFA / buz üzerinde 30 dakika süreyle PBS.
- Buz üzerinde 30 dakika PBS-Triton X (0.15%) 3 kez yıkayın.
- % 25 MeOH,% 50 MeOH,% 75 MeOH, ve her adım için 10 dakika sonra% 100 MeOH: bir aşamalı MeOH / PBS-Triton X dizi örnekleri kurutmak. 10 dakika sonra taze MeOH ile% 100 MeOH değiştirin ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edilir.
- Bir cam kapta, mix Babb (Benzil Alkol: Benzil Benzoat) 1:2 oranında. Babb% 50 ve% 50 MeOH bir nihai konsantrasyon için MeOH ile Babb birleştirin. 10-15 dakika MeOH: Babb örnek inkübe edin.
- Transferi sa10-15 dakika için% 100 Babb ve inkübe ile bir cam kap için mple veya kadar oda sıcaklığında, temizlenir.
- Tarafı taze% 100 Babb ve transfer örneği ile depresyon slayt (0.7mm derinlik) doldurun. Cam (No 1.5) kapak ve oje 2-3 kat ile mühür ekleyin. Oda sıcaklığında karanlıkta sertleşmesine oje bırakın ve daha sonra 4 ° C'de örnek saklamak
Not: Slaytlar tamamen konfokal görüntü alımı öncesinde kapatılmalıdır. Floresan boyalar Babb fade gibi Görüntüler, 12-24 saat içinde satın alınmalıdır. - 'Image Acquisition' bölümüne geçin.
5. Görüntü edinimi
- Görüntü 10 488 ile Plan-Apochromat 20X/0.8 nesnel (512 X 512 piksel) kullanarak bir konfokal mikroskop ile mikron frozen - (FITC-dextran/GSL 1 - B 4 isolectin), 543 - ve 633-nm lazer çizgiler.
- Plan-Apochroma kullanarak bütün montaj cilt ve 50 mikron agaroz-gömülü kesitlerin konfokal z bölümler Edinme t 10X/0.4 488 ile nesnel (512 X 512 piksel) - (FITC-dextran/GSL 1 - B 4 isolectin), 543 - ve 633-nm lazer çizgiler. Seri Z bölümleri ilgili her kanal için 1 mikron sıralı olarak toplanmalıdır.
- Seri Yeniden İnşa Zeiss Axiovision 4.6 ya da diğer görüntü analiz yazılımı kullanılarak Z-bölümler.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Embriyonik damar Verimli etiketleme embriyonik farelerde kan damarı kusurları değerlendirmek için önemlidir. Şekil 1, sırasıyla sağ ve sol ventrikül (1E-F) arasında boyama ek olarak, özel E16.5 timüs kan damarlarının etiketleme (1A-B) ve CD31 (1B) ile birlikte etiketleme, göstermektedir. Gibi bölümlere 1, 3 içinde belirtilen cryosections ve 5 için GSL I-isolectin B 4 protokol bu deneylerde kullanılmıştır. Bütün monte edilir, E16.5 fareler üzerinde cilt kan damar ağının bölümleri etiketleme 1, 2 içerisinde tarif edilen protokoller kullanılarak, ve 5, şekil 1C-B 'de gösterilmiştir.
ntent ">
1. Legend Şekil. FITC GSL I - E16.5 fare embriyolarına isolectin B 4 yüz ven enjeksiyonlar. embriyonik kalp
e enjeksiyonu takiben embriyonik Timus
bir. Cryosection.
b. isolectin B
4 CD31 ko-etiketleme Birleştirme.
c. ve
d. embriyonik deri vaskülatürü aşağıdaki enjeksiyon Tüm montaj.
e. ve
f. Cryosection. (sağ ventrikül)
f. (sol ventrikül) aşağıdaki enjeksiyon.