Method Article

Bir Modifiye Zigmond Odası Testi kullanılarak Trunk Sinir Crest Hücre Göç Analizi

DOI:

10.3791/3330

⸱

January 19th, 2012

 ,  , 
1Department of Biology, California State University, Northridge, 2Centro de Biología Celular y Molecular, Universidad Nacional de Córdoba

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksplante hücreleri (gövde nöral krest hücreleri) göçü analiz etmek bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, pahalı yumuşak, ve bu gibi ana gövde tepe nöral hücre kültürü içinde hücre-hücre etkileşimleri türetilmiş olanlar gibi, göç polarite hem chemokinesis ve diğer etkilerden kemotaksisi ayrım yapabilmektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöral krest hücrelerinden (NCCS) epitelyal-mezenkimal geçiş 1,2 geçirildikten sonra dorsal nöral tüp (NT) göç omurgalı gelişimi mevcut hücrelerin geçici bir nüfusu vardır. Onların hedeflerine ulaşana kadar EMT ardından NCCS stereotipik yollar boyunca büyük mesafeler göç. NCCS nöronlar, glia, melanosit ve 1-3 kromaffin hücreleri de içeren farklı hücre tipleri geniş bir dizi farklılaşırlar. Onların doğru hedef konumlarına ulaşmak ve tanımak NCCS yeteneği gövde bileşenleri 3 NCC-türetilmiş içeren tüm yapıların uygun oluşumu için temel olduğunu. Gövde KKK göç için rehberlik mekanizmalarının aydınlatılmasına dolayısıyla büyük önem taşıyan bir konu olmuştur. Sayısız molekülleri KKK göç 4 yol gösterilmiştir. Örneğin, gövde NCCS bu tür Semaphorin, efrin ve yarık ligandları olarak 5-8 negatif kılavuz işaretler tarafından uzaklaştırılacaktır bilinmektedir. Ancak,Son zamanlarda gövde NCCS 9 belirlenmiştir herhangi chemoattractants kadar.

Yapışık hücrelerin kemotaktik davranışlarını incelemek üzere in vitro yaklaşımlar Konvansiyonel ölümsüzleştirdiği, homojen dağıldığı hücreler en iyi şekilde çalışır, ancak başlangıçta homojen bir dağılım eksikliği ve hızla (örneğin NCCS gibi) ayırt bazı primer kök hücre kültürleri uygulamak daha zor. Kemotaksisi çalışmaları için gövde NCCS dağılımı homojenize Bir yaklaşım birincil NT eksplant kültürlerden gelen gövde NCCS izole etmektir, sonra kaldırın ve onları neredeyse% 100 konfluent olmak replate. Ancak, bu kaplama yaklaşım, zaman ve yeterli hücre eksplantasyona çaba önemli miktarda gerektirir sert olduğunu, ve in vivo koşullarda bulunan bir farklı şekilde gövde NCCS dağıtır.

Burada, requirin olmadan gövde NCCS arasında kemotaksis ve diğer göçmen yanıtları değerlendirmek mümkün bir in vitro yaklaşımı raporhomojen hücre dağılımı ga. Bu teknik, primer time-lapse görüntüleme kullanan bir modifiye Zigmond odası (standart Zigmond odası başka bir yerde 10 açıklanan) iç gövde NCCS soğukkanlı. Bunların tahmin edilen doğal yön dik bir chemotactant gradyanı ile kültür çevresinde yer alan gövde NCCS açığa olarak, uygulanan chemotactant gradyanı ile oluşturulan göç polarite değişiklikler tespit edilebilir. Bu teknik, ucuz çoğaltma tedavi başına sadece iki NT eksplant kültür gerektirir, sert hücre kaldırma (örneğin tripsinizasyonla gibi) önler vivo koşullarda bir daha benzer dağılımda gövde NCCS bırakır eksplantasyonunun ve deneme arasındaki süreyi aşağı kesim (hangi büyük olasılıkla farklılaşma riskini azaltır), ve çok sayıda göçmen özellikleri time-lapse değerlendirilmesine olanak tanımaktadır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 1. Gün: lamelleri gecede kültür gövde nöral tüp İzolasyonu

  1. 38 az 56 saat süreyle civciv yumurta inkübe ° C inkübasyon yumurta çıkarın, hafif% 70 Etanol ile onları sprey, ve sonra onları kurutun. UV-steril cam tepsi içine açık yumurtaları kırın.
  2. Sarisi her embriyo ayıklayın ve civciv Ringer yerleştirin. Kavisli makas ile kan adaların etrafında ilk kesim tarafından bu yapın; ardından, künt forseps ile, onun extraembryonic zarla embriyo pick up ve civciv Ringer çözeltisi içeren bir steril plastik Petri kabı yerleştirin.
  3. Aşırı extraembryonic membranlar kapalı kırparak yanı sıra bir tungsten iğne (Şekil 1) kullanarak, kranial vagal ve sak....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gövde NCCS üzerine kemotaksis araştırmaların yapılması nedenlerle bir dizi için zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, gövde NCCS gövde düzeyinde NT birincil eksplantasyonunun alınmalıdır; Trunk NCCS kültürlü uzun vadede ise farklılaştıracak bir heterojen kök hücre popülasyonu oluşturur. In vitro homojen dağıldığı hücre popülasyonlarının kemotaktik yanıtı incelemek için konvansiyonel yöntemler onlar ilk hücreler izole ve kemotaksis odası (örneğin, bir Boyden çemberinin 12) replated homojen olmasını g.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bu yöntemin geliştirilmesi sırasında teknik yardım için Lino Kim, Steve Guzman ve Ujit Satyarthi özel şükretmezler. Myron Hawthorne, Richard Spengel ve Roberto Rojas burada kullanılan odaları işlenmiş ve çok ihtiyaç duyulan teknik yardım sağlamıştır. Özellikle, Roberto Rojas Şekil 4 üretti. Biz de yukarıda kemotaksis assay gelişimi öncesinde Scott Fraser değerli tavsiyeler için müteşekkiriz. Bu çalışma kısmen bir NIH-MBR SKOR-5S06GM048680-13 Medb ait ve CW CSU, Northridge Lisans Tez Destekleme Programı bir ödül tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
DMEM Omega Bilimsel DM-22
Penisilin Streptomisin Çözüm Omega Bilimsel PS-20 100X Stok Konsantrasyon
L-Glutamine Omega Bilimsel GS-60 100X Stok Konsantrasyon
Fetal Bovine Serum Omega Bilimsel FB-11 Lot # 105247 (veya karşılaştırılabilir başka)
Modifiye Zigmond odası Home made N / A Rezervuar hacmi: ~ 160 ul adet, ek özellikler için, bkz. 4 ve ek imalat protokolü
Hücre kültürü çanak Denville T6040 40 x 10 mm
Fibronektin BD 354008 10X Hazır 1 ml H2O ve 9 ml DMEM içinde 1 mg FN seyreltilmesi ile prepped
Lameller Balıkçı 12-548-B Precleaned; 22 x 22 mm
L15 orta Thermo Scientific SH30525.02
Vazelin Comforts 011110794642 % 100
Santrifüj tüpü Biologix 10-9152 15 ml
Dispase Hücre Sistemleri 4Z0-850 10X Stok Konsantrasyon
Şırınga BD 309602 1 mL
Iğne BD 305127 25 G x 1,5 inç
Alexa Fluor 488-IgM Bennvitrogen A21042 Hazır 2 mg / ml 'dir; 7 mol boya / mol IgM
Diseksiyon Forseps FST Misc. Dumont # 5 veya 55; düz uçlu, paslanmaz çelik ya da titanyum
Tungsten İğne N / A N / A Ev yapımı; pim tutucu yerleştirilir
Blunt Forseps Tiemann 160-18 Yumurta sarısı Ringer embriyo transferi için kullanılır

Ek Protokol: Modifiye Zigmond Odası Fabrikasyon

Aşağıdaki protokol için bir referans olarak Şekil 4'e bakınız:

  1. 3/16 "kalınlığında akrilik cilalı (4.45 mm gerçek kalınlığı) bir levha satın alın.
  2. Bir tablo kullanarak 33,25 mm x 64,57 mm kaba boyutları normalden büyük kamara boşlukları kesip, gördüm. Bu işleme için 3.175 mm ekstra malzeme sağlar.
  3. Bir vi odacık blank ayarlayınse. 30.07 mm x 61.39 mm: Bir freze makinesi ve 6,35 mm (1/4 ") freze ucu, finiş onların tam boyutlarına odasının tarafı ile.
  4. Freze makinesi üzerindeki odacık blank konumlandırın ve x ve bir kenar bulucu ile y ekseni hem boyunca boş merkezinin yerini, sonra merkezi konumu sıfır.
  5. Üst yüzeyine sonuna değirmen biraz dokunarak odası yüksekliği (z-ekseni) Edinme ve yüksekliği sıfır.
  6. Bir 3.91 mm (0,154 ") freze ucu kullanarak, ilk rezervuar için x-ekseni (pozitif yönde) boyunca bit 3.03 mm ofset. Y-ekseni boyunca hareket ederken (2.84 mm derinliğe kadar odasına işleme başlayın 7.62 mm (0.300 ile) yönünde pozitif 15.24 mm (0.600 ") tam bir rezervuar uzunluğa karşı (negatif) yönünde)" O) ve 7.62 mm (0.300 ile çapraz ". X-ekseni (negatif yönünde) 3.03 mm (0.119 ") için bit Ofset ve ikinci hazne için aynı işlem tekrarlayın.
  7. Onun kenarında odasına yerleştirinve deney sırasında orta yükleme odasının yan rezervuarın sonunda her bağlandığında rezervuar (toplam 4) ucunda bir 1.09 mm (0.043) matkap ucu kullanarak bir delik açın.
  8. Herhangi bir kimyasal kirleticiler kaldırmak için ılık sabunlu su ile iyice odası bekletin.
  9. Herhangi bir sabun kaldırmak için çift distile su ile iyice odası bekletin ve durulayın. Odası hemen yukarıda tarif edildiği gibi kullanıma hazırdır.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
  2. Baker, C. V. Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , 4th edn, Springer. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Trunk Neural CrestNeural TubeModified Zigmond ChamberChemotaxis AssayTime lapse ImagingCell Migration AnalysisImage J TrackingNeural Crest IsolationMolecular GradientMigratory Polarity

Related Articles