Bir Ortotopik Fare Beyin Tümörü Modelinde Kombinasyon Radyoterapi

Özet

Bu makalenin amacı, kemoradyoterapi çalışmaları için ortotopik glioblastoma modelinin kullanımı tanımlamaktır. Bu makale implante, hücre işleme rağmen gitmek ve bir intrakraniyal modeli kullanarak farenin radyoterapi olacaktır.

Özet

Glioblastoma multiforme (GBM) ¹ en yaygın ve agresif erişkin primer beyin tümörlerdir. Son yıllarda da, tümör mekaniğinin anlaşılması konusunda önemli ilerleme olmuştur ve tümörün doğrudan intraserebral inokülasyonu fizyolojik olarak uygun ortamda ² invaziv süreci gözlemleme fırsatı sağlar etti. Bildiğim kadarıyla insan beyin tümörleri ile ilgili olarak, mevcut ortotopik modelleri karmaşık bir kraniotomi prosedürü ³ ile tümörün sağlam bir parça hücre süspansiyonları veya implantasyon stereotaksik enjeksiyon yoluyla kurulur. Bizim teknik olarak beynin doğrudan implant kullanılan bir hücre süspansiyonu oluşturmak için doku kültürü hücreleri toplamak. Cerrahi süresi yaklaşık 30 dakika ve fare sabit bir cerrahi düzlemi içinde olması gerekmektedir olarak, enjekte edilebilir bir anestezik kullanılır. Fare Stoetling (Şekil 1) tarafından yapılan bir stereotaksik jig yerleştirilir. Kıçtaer cerrahi alan temizlenir ve hazırlanır, bir kesi yapılır ve bregma kraniotomi yerini belirlemek için yer almaktadır. Kraniotomi yeri sağ 2 mm ve bregma için rostral 1 mm'dir. Derinliği kafatası yüzeyinden 3 mm'dir ve hücreler 2 ul her bir 2 dakika arasında bir hızla enjekte edilir. Cilt 5-0 PDS ile sütüre edilir ve farenin bir ısıtma yastığı uyanmak için izin verilir. Bizim deneyim, hücre serisine bağlı olarak, cerrahi tedavi sonrası 7-10 gün arasında yer alabilir. İlaç dağıtım ilaç bileşimi bağlıdır. Radyasyon tedavisi için fareler anestezi, ve jig yapılan özel koymak. Kurşun farenin vücudu kaplar ve farenin sadece beynin ortaya koyar. Tümörogenez ve GBM için yeni tedavilerin değerlendirilmesi çalışması doğru ve tekrarlanabilir beyin tümörü hayvan modelleri gerektirir. Böylece YÜRÜRLÜK test etmek, beynin mikro ve tümörün etkileşimi incelemek için bu ortotopik beyin modeli kullanınradyasyon olan ve olmayan farklı terapötik ajanların ess.

Protokol

I. Hücre Hazırlık

1. Hücreler implante edilmesi her 5 fareler için bir 80% konfluent 225 cm ³ şişeyi yaklaşık% 10 FBS ile DMEM birleştiği yetiştirilmektedir.
2. Hücre kapama ortamı aspire; kalsiyum veya magnezyum olmaksızın PBS ile 10 ml ile yıkanır. Aspirat PBS kapalı hücreler.
3. Tripsin 3 ml hücreleri Trypsinize, 10-15 dakika bekleyin ve medya 15 ml tripsin nötralize.
4. Pipet bir 50 ml konik içine tüm hücreleri ve medya. İki büyük şişeler biri 50 ml konik içine sığacak.
5. 4 ° C'de 7 dakika boyunca 1600 rpm'de hücreleri Spin Tamamen süpernatant aspire. Soğuk PBS 10 ml hücre süspansiyon hale getirin ve yavaşça aşağı pipetleme ve hücreleri durulayın. Hücre pelletini PBS ile eşit karıştırılarak emin olun. Süspansiyon bulanık olmalıdır.
6. Şu anda bir hücre sayımı coulter sayacı kullanılarak yapılır. Hücreler 4 ° C'de 7 dakika boyunca 1600 rpm'de santrifüje tabi tekrar edilir
7. Hücrelerinin ^2. santrifüjleme gibi sonraPBS 1 ml korsan tüm PBS ve Pastör pipetiyle.
8. Hücreler 4 ° C'de 10 dakika süre ile 3000 rpm'de 1 ml PBS içinde bükülmüş edilir PBS aspire edilir, ve PBS U87 hücreleri için 5 ul başına 1x10 ^{6 ila} son konsantrasyon ayarlamak için eklenmektedir, diğer hücre çizgileri optimum tümör büyümesi için hücreleri, farklı sayıda ve konsantrasyon gerektirebilir.
9. Son hacim ve konsantrasyon elde edildikten sonra hücreler bir Eppendorf tüpüne buz üzerinde tutulur.

II. Xenograftlarında

1. Farenin hazırlanması
   1. Fareler Ketamin / Ksilazin / Tuzlu bir enjeksiyon karışımını kullanarak anestezi uygulanmıştır. Karışım 120 Ketamine, 16 mg / spinal anestezi ve tuzlu su kg mg / kg 'dır. Fareler bireysel tartılmış ve ağırlık temelinde 10 g başına 0.1 ml verilmiştir. Anestezi 1 ml şırınga IP bağlı 26G iğne ile verilir. Hiçbir ağrı yanıt için bir uyku safhaya fareler için yaklaşık 15 dakika sürecektir. Bu ağrı yanıtı kontrol edebilirsinizonların haydut sıkıştırarak fareler.
   2. Fare tamamen uyuşturulduktan sonra, göz merhemi kurumasını engellemek için gözlerini tatbik edilmiştir.
   3. Fare ağız çubuğundaki çentik ön üst dişler ile stereotaksik yatağına yerleştirilir. Daha sonra oda stereotaksik yerleştirilir.
   4. Burun koruma baş hareketini önlemek için, ve kulak çubukları hafifçe farelerin kulak kanalları yerleştirmek olan farenin burnunun üzerine yerleştirilir. Kafatası kırık ve / veya nefes almasını engelleyebilir fare gibi, burun çubuğu ya da çok sıkı kulak çubukları ya yerleştirme yapmak için dikkatli olun.
   5. Fare kafası stereotaksik üzerindeki onay işareti kullanarak seviyesi bu süreçte yararlı olduğundan emin olun.
   6. Hazırlık için fare, alkol ve providine iyot iyot alkol ve 3 uygulamanın 3 uygulama toplam alternatif farenin başına bolca uygulanır. % 70 olan bir alkol pedi biri nihai uygulama içinkafası.
2. Cerrahi girişim
   1. Prosedüründe tüm enstrümanlar prosedürü başlamadan önce% 70 etanol araçları otoklav veya iliklerine yoluyla sterilize edilmelidir.
   2. Bir insizyon çapraz geri kafatasının sol arka için sağ göz arkasında kafatası üstüne yapılır. Kesi 10 mm uzunluğunda 15 mm olmalıdır.
   3. Bir Q-tip kullanarak, yavaş yavaş kafatası maruz ve kafatası ve cilt arasında membran silip için kesi ayırın. Aşırı kanama için herhangi bir kan kurulayın ve izlemek için bir Q-ucu kullanın.
   4. Bregma görselleştirmek için kafatasının üst Açığa. Hamilton enjektörü noktasını kullanarak, bregma üzerine getirin. Kafatasında açılacak deliğin doğru pozisyonda 2 mm sağ ve bregma (Şekil 2) anterior 1 mm'dir. Steril satın alındığında bir cerrahın keçeli işaretleyici, açılacak deliğinin yeri işaretlemek için kullanılır. Delik bir yakın bulunan unutmayınposterior sütür hattı.
   5. Sonra, bir 18G iğne ile bir iğne vazo ya da beslenen bir 22G iğne noktası kullanarak işaretli konumda kafatasına küçük bir delik açın.
   6. Hücrelerin 5 ul ile 10 ul cam Hamilton şırınga yerleştirin. Hamilton enjektörü ile ona bağlı 33G sabit iğneli bir künt 30G ile 10 ul olduğunu. Onları pipetleme ya bağlı bir 25G iğne ile 1 ml şırınga kullanılarak, ya yüklemeden önce hücreleri karıştırmak için emin olun. Hamilton enjektörü yüklendikten sonra, kafatasında delik ile sıraya kolunda geri koyun.
   7. Iğne kafatası ile seviyesini bir kez, kafatasının yüzeyine iğne bunt sonuna indirin; bu kafatasının yüzeyinin altında 3 mm derinliğe kadar iğne indirin.
   8. Iğne indirdi sonra, beyin etkileyen iğne herhangi bir majör travma önlemek için 2 dakika için orada kalacaktır. Hücreler implante 6-8 dakika toplam için dakikada 1 ul'lik bir hızda olan, herhangi bir backflo dikkatli olmakw. Hücreler son implante edildikten sonra, bütün hücrelerin in getirilmesi için izin vermek üzere, bir 2 dakika süreyle bir yerde iğne terk
   9. Beyinden iğne çıkarın ve bir Q-tip ile delik temizleyin. Her bir çözüm ve bu sırada 3x% 50 Actone,% 100 EtOH ve PBS ile iğne ve şırınga temizlemek için devam edin.
   10. Kafatası üzerinde cilt bu noktada dikilerek üzere hazırdır. 5-0 kullanma PBS yaklaşık 3 dikiş ile kesi kapatın.
   11. Fare bir ısı yastığı uyanmak için izin ver, ve gerekirse göz merhemi yeniden uygulayın. Kendi kendine hareket gösterir sonra fare kafesine iade edilebilir (yani başını yukarı kaldırılması veya omuzları hareket).

III. Radyasyon ve Uyuşturucu ile IC implant tedavisi

1. Radyasyon tedavisi
   1. Hücre hattı bağlı olarak, farelerin tedavisi 7 gün post-implant yerine 5 alabilir. Bölümümüz radyasyon tedavi için bir orthovoltage radyoterapi ünitesi kullanırMent.
   2. Böyle BLI (Biyolüminesens Görüntüleme), MR veya BT gibi görüntüleme öncesinde randomizasyon (şekil 3A) tümör görselleştirmek için kullanılabilir.
   3. Farelerde önceki gibi Ketamine / Xylazine / salin kokteyli ile anestezi uygulanmıştır, merhem ve göz gözlerine uygulanır.
   4. Fareler farelerin başları merkezine doğru işaret edildiği bir pasta tekerlek gibi yapılandırılmış bir ölçüye radyasyon jig konumlandırılmıştır. Farelerin organları kurşun radyasyon korumalıdır.
   5. İlaç tedavisi farklı teslimat yollarının, yani SQ, IP ve IV aracılığıyla önce ya da radyasyon da verilebilir.

IV. Sonuçlar

Fare anestezi enjeksiyonu takiben 45-60 dakika içinde prosedürü uyanmak gerekir. Fare zor işlemden sonra uyanma ve süresi 1 aştı ½ saat işlemden sonra, fare kurtarmak olmayabilir ve ötanazi etkili bir alternatif olabilir. Eğer there aşırı kanama veya prosedür ötanazi sırasında herhangi bir noktada kırık kafatası olur tavsiye edilir. Tüm iyi ve hücre serisine bağlı olarak giderse prosedürü gerçekleşecek olan sonra, bir tümör 2-4 hafta içinde oluşturan başlamalıdır. Intrakraniyal xenograft modelleri kullanırken, terapötik etkinlik genellikle hayatta implantasyon sonrası ⁵ olarak ölçülür. Ancak, bu gibi bir IC modeli belirti ve bulgular önce ölüm meydana gelir. Fare görülebilir fiziksel belirtileri bazıları bir kambur duruş, vücut ağırlığı kaybı ve hareketsizlik vardır. Nörolojik bulguların bazıları nöbetler, baş eğme ve denge kaybı olabilir. Şekil 3B bir HE ölüm bir tümörün leke gösterir. Bir Kaplan-Meier arsa verileri (Şekil 4) değerlendirmek için kullanılır. % 50 hayatta kalma gün sayısı hesaplanır ve kontrol ile karşılaştırılmıştır. Bileşimi grubu bireysel radyasyon ve ilaç kollarının Ayrıca daha uzun yaşasaydınız kombinasyonu başarılı edilir.

Şekil 1. Stoelting Stereotaksik ekipmanları.

Şekil 2. Fare kafatasında açılan deliğin yerini şeması.

GBM implantasyonu sonrası Şekil 3A. BLI görüntüleme.

Şekil 3B. Ölüm H ve GBM tümör D.

Şekil 4. PARP inhibitörü 7 gün sonrası cerrahi ile enjekte U87 IC implantların Sonuçları.

Tartışma

Gibi glioblastoma multiforme Malign gliom, en sık rastlanan primer beyin tümörleri temsil ve kasvetli bir prognoz ⁴ var. GBM etkilenen hastaların sağkalım cerrahi, radyasyon ve kemoterapi ⁵ gelişmelere rağmen (9-12 yani ay sonrası tanı) son on yılda hemen hemen hiç değişmedi. Hücrelerinin, insan gliom histolojik özellikleri mümkün olduğunca yakın benzerlik olmalıdır;; tahmin edilebilir bir büyüme olmalıdır glioma muamele çalışma için uygun bir model özellikleri tekrarlanabilir bir tümör büyümesi ko...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Lab Standart Stereotaksik Instrutment	Fare ve Rat Adaptör Stoelting
Betadine	% 100 EtOH
% 70 EtOH	% 50 aseton
6 "Q-ipuçları	Alkol swablar
Hamilton enjektörü 80.008	Ethicon 5-0 PD
1701 SN 31-33G / 1 "/ PT3 iğne	1 ml şırınga
25G iğne	Isıtma pedi
Suni gözyaşları Merhem	Çok ince uçlu kalıcı bir kalem