Yöntem makalesi

Çoğaltım ve Yeşil floresan proteini ifade Maedi-visna Virüs bir Enfeksiyöz Moleküler Clone algılama

9.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/3483

⸱

9 Ekim 2011

 , 
1Institute for Experimental Pathology, University of Iceland

Bu makalede

Özet

Biz, GFP ifade eden ve tam olarak bulaşıcı olan Maedi-visna virüs bir moleküler klon tanımlamak. Bu virüs çoğaltma floresan mikroskopisi ve akış sitometrisi ile tespit edilebilir.

Özet

Maedi-visna virüsü (MVV) yavaş ilerleyen interstisyel pnömoni ve ensefalit 1 neden, koyun lentivirüs olduğunu. In vivo olarak MVV birincil hedef hücrelerin monosit 2 olduğu kabul edilir. MVV Bazı suşları ancak 3,4, diğer hücre tiplerinde çoğaltabilirsiniz. Yeşil floresan protein canlı hücrelerde lentiviruses incelemek için yaygın olarak kullanılan bir göstergedir. Biz MVV dUTPase için geninin içine EGFP gen taktınız. DUTPase geni de çoğu lentivirüs koyun suşu ve keçi korunduğu ve CAEV 5 çoğaltma önemli olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, dUTPase in vitro ve in vivo 6 hem de bu çalışmada kullanılan MVV moleküler klon çoğaltılması için vazgeçilebilir olduğu gösterilmiştir. MVV çoğaltma kesinlikle koyun veya keçi kaynaklı hücreler ile sınırlıdır. Biz transfeksiyon ve virüsün 7 yayılması için koyun koroid pleksus (SCP hücreleri) bir birincil hücre hattı kullanın </> Sup. Floresan MVV tamamen bulaşıcıdır ve EGFP ifadesi en az 6 pasajlar üzerinde 8 sabittir. TCID 50 ve EGFP ölçümleri arasında iyi bir korelasyon vardır. Bu nedenle, virüs hücre tropizm ve in vitro ve in vivo 8 patojen çalışmalarda enfekte hücrelerin hızlı tespit için yararlı olacaktır.

Protokol

1. Transfeksiyon

Moleküler klon sırasıyla 12 kb ve 4.5 kb'lik iki plazmit, p8XSp5-EGFP ve p67r, içinde yer alır. 9,10

  1. Iki plazmit, yani p8XSp5-EGFP 4.4 ug ve Xbal ile p67r 1.6 ug eşit molar miktarlarda kesme ve transfeksiyondan önce Arter.
  2. Ligasyon için, 16 ° C'da gece boyunca bir 50 ul reaksiyon ile inkübe ligaz 1 Weiss birimi kullanılır.
  3. Ligasyon tamamlandığında, ligaz inaktivasyonu için 15 dakika süreyle 65 ° C'de inkübe edilir ligasyon karışımı. Bu adım, ihmal edilebilir.
  4. İki gün önce transfeksiyon, tohum 10 6 SCP bir T25 doku kültürü şişesi hücreleri, ve% 90 confluency bir tek tabaka antibiyotik olmadan 5 ml DMEM +% 10 kuzu serum ve 2mM glutamin iki gün boyunca hücreler büyür. Hücreler iki gün sonra% 90 confluency ulaşmış değil varsa, hücreler ek bir gün büyümeye bırakın.

Not: Kuzu serum subs olabilirfetal bovin serumu (FBS) ile tituted. MVV bazı suşları FBS tarafından inhibe edilir beri rutin, kuzu serum kullanın; Bu MVV suşu Ancak, FBS tarafından inhibe edilmez.

  1. Hücrelerin transfeksiyon için hazır olduğunuzda, antibiyotikler olmadan% 1 serum (kuzu serum veya FBS) ile DMEM orta değiştirin.
    Bu transfeksiyon için Lipofectamin 2000 (Invitrogen) kullanılır.
  2. 500μl Opti-MEM ortam maddesi içinde DNA seyreltilir.
  3. 500μl Opti-MEM ortam maddesi içinde 20uL Lipofectamin 2000 seyreltilir ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) olarak bırakın.
  4. 5 dakika inkübasyondan sonra, seyreltilmiş lipofektamin 2000 (toplam hacim = 1000 ul) ile seyreltilmiş DNA birleştirir. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edilir.
  5. SCP hücreler ve ortam (5 mi) içeren bir şişeye T25 transfeksiyon karışımı (1 ml) ilave edilir. Hafifçe sallayarak karıştırın.
  6. 37 ° C'de inkübe edin ve gece boyunca% 5 CO 2 (18-24 saat).
  7. % 1 serumu, 2mM glutamin ile DMEM ile ertesi gün ortam değiştirme100 IU penisilin ve 100 IU, streptomisin.
  8. Ters flüoresan mikroskop ile SCP hücrelerde GFP üretim izlenmesi. % 15 - Düşük transfeksiyon verimliliği genellikle 5 bu birincil hücreler ile beklenebilir.
  9. Inkübe 37 daha fazla ° C,% 5 şişe içerisinde virüsün yayılmasını sağlamak için birkaç gün boyunca CO2. Genellikle tam enfeksiyonu için 7-14 gün sürer.
  10. Eppendorf tüpleri içine süpernatant aliquoting tarafından virüs Harvest. Hücre enkaz kaldırmak için 5 dakika süreyle 3000 rpm'de bir mikrofuge'de yılında Spin. Yeni tüplere virüs içeren süpernatant aktarın. -80 ° C de saklayınız

2. Virüs titrasyonu

  1. Bir 96 oyuklu plaka içinde% 10 serumu, 2mM glutamin, penisilin ve 100IU/ml 100IU/ml streptomisin, kuyu başına ile desteklenmiş 100 ul DMEM ortamı içinde Seed 3x10 4 SCP hücreleri. 37 inkübe ° C,% 5 CO2.
  2. Ertesi gün hücreler confluent ise,% 1 serum ile DMEM ortamı ile değiştirmek, 2mM glutamin, 100IU/ml penisilin ve 100IU/ml streptomisin, her bir kuyunun 100 ul.
  3. Aşağıdaki gibi virüs inceltilir
    1. 2mM glutamin, 100IU/ml penisilin ve 96 yuvarlak alt veya V-alt plaka 4 x 10 kuyu için kuyu başına 100IU/ml streptomisin,% 1 serum ile 180 ul DMEM ekleyin.
    2. Dörderli seri on kat dilüsyonları için, numunelerin iyice karışmalarını sağlamak için plaka ilk sütununda 4wells her virüs 20 ul ekleyin ve dört-kanallı pipet kullanarak, ve aşağı yukarı pipetle. Pipet uçları değiştirin ve sonraki 4 kuyu ve böylece 20 ul aktarın. Negatif kontrol için, bir virüs olmadan son kuyu bırakın.
  4. SCP hücreleri ve orta virüs seyreltmeleri 100 ul ekle.
  5. 37 inkübe ° C ve% 5 CO2. GFP flöresanı ve iki hafta için sitopatik etkiler için dikkate alınmalıdır.
    Sitopatik etkiler yuvarlak ve normal hücrelere göre daha az şeffaf hale hücre oluşur wITH süreçleri multinükleer görünen hücreleri ve hücre ölümü ile biten, dışarı uzanan.
  6. Reed Muench yöntemi 11 kullanarak virüs titresi (TCID50) hesaplayın.

3. Enfekte hücreler FACS analizi

Not: virüs çoğaltma hızlı izlenmesi için enfekte hücreler flow sitometri ile incelenebilir.

  1. Enfekte hücreler (ca 10 5) Trypsinize, 500μl PBS PBS ve tekrar süspansiyon ile 1x yıkayın.
  2. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe 500 ul% 4 paraformaldehid çözeltisi (% 2 nihai konsantrasyon) ekleyin.
  3. 5 dakika için 3000 rpm'de bir mikrofüj Pelet hücreler.
  4. PBS 2x5 dakika ile yıkayınız ve bir FACScan analizöründe analiz. 10,000 olaylar sayın.

4. Temsilcisi sonuçları:

10 7 TCID 50 / ml - Bu virüs tamamen bulaşıcı ve 10 6 titrede çoğaltılması olmalıdır. Enfekte hücrelerin floresan ve det olabilirflow sitometri ve floresans mikroskobu tarafından etkilenen. Tipik olarak, GFP akış sitometresi kullanılarak hücre kültürlerinde enfekte olmuş (Şekil 1) içinde hücrelerin% 60'ından daha fazla olarak tespit edilebilir. Aynı şekilde, floresan mikroskopisi ile analiz zaman, hücrelerin bir kısmı (Şekil 2A ve B) floresan vardır.

Şekil 1
Şekil 1. Enfeksiyon 7 gün sonra KV1772-EGFP virüs ile enfekte olan hücrelerin SCP FACScan analizi.

Şekil 2
7 günlük inkübasyon (A) sonra KV1772-EGFP ile enfekte SCP hücrelerin Şekil 2. Faz kontrast mikroskobu. Aynı hücreler floresan mikroskobu (B) gözlemlenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan MVV moleküler klon GFP ifade eden ev sahibi hücre etkileşimleri ve in vitro ve in vivo olarak MVV patojenitesi analiz etmek için yararlı olacaktır. Çoğaltma 7-14 gün sonra elde edilen virüs hiç şüphesiz ters transkriptaz hata nedeniyle bazı mutasyonlar sahip olmuştur. Bununla birlikte, tek bir döngü vektör olarak bu klon kullanımı için bir sınırlama yoktur. Bir klon kullanımı koyun ve keçi kaynaklı hücreler ile sınırlı olmasıdır. Bizim yapısı kullanılarak bu hücrelerden transfeksiyon verimi sadece% 5-15 v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu çalışma İzlandalı Araştırma Fonu ve İzlanda Araştırma Fonu Üniversitesi tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası
DMEM Gibco 10938025
Opti-MEM Gibco 51985018
Lipofektamin 2000 Invitrogen 11668019

Kaynaklar

  1. Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).
  2. Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes. J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).
  3. Andresdottir, V. Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus. Virus Genes. 16, 281-293 (1998).
  4. Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence. Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).
  5. Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions. J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).
  6. Petursson, G. Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity. J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).
  7. Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. Cultivation of visna virus in tissue culture. Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).
  8. Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein. J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).
  9. Andresson, O. S. Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus. Virology. 193, 89-105 (1993).
  10. Skraban, R. Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype. J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).
  11. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
  12. Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity. Virology. 279, 116-129 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Koyun Koroid Pleksus H creleriFloresan MikroskobuAk SitometrisiViral Titre AnaliziTCID50 l mPlazmid TransfeksiyonuVir s PropagasyonuSitopatik Etkiler

İlgili makaleler