Yapışma için Frekans Testi Yerinde Kinetik Analizi

Özet

Hem molekülleri etkileşen hücrelerin yüzeylerinde demirlemiş olan reseptör-ligand etkileşimi kinetiği ölçmek için bir yapışma frekans tahlil açıklanmıştır. Bu mekanik tabanlı test mikropipet basınçlı bir insan adezyon sensörü olarak kırmızı kan hücresi ve integrin αLβ2 ve hücrelerarası adezyon molekülü-1 reseptörleri ve ligandlar etkileşim olarak kullanarak örneklenir.

Özet

Mikropipet yapışma testinin iki boyutlu (2D) reseptör-ligand bağlayıcı kinetiği ¹ ölçmek için 1998 yılında geliştirilmiştir. Tahlil yapışma sensörü ve etkileşen moleküllerin birini sunan hücre gibi bir insan kırmızı kan hücreleri (RBC) kullanır. RBC, tam kontrol ve bağ oluşumunu sağlamak için diğer etkileşim molekülü ifade başka bir hücre ile temas getirmek için mikromanipülasyon kullanmaktadır. Yapışma olayı birbirinden ayrı iki hücre çekerek üzerine RBC uzama olarak algılanır. RBC yüzeyinde hareketsiz ligandlar yoğunluğu kontrol ederek, yapışma olasılığı 0 ile 1 arasında orta menzilli tutulur. Yapışma olasılığı belirli bir temas süresi için iki hücre arasındaki tekrarlanan temas döngülerinin bir dizi frekans adezyon olaylar tahmin edilmektedir. Zamanla değişen bağlayıcı bir eğri oluşturur. Bağlayıcı reseptör-ligand reaksiyon kinetiği ¹ olasılıklı model uydurmaeğrisi 2B yakınlık ve kapatma hızı ile döner.

Assay, IgG ^{Fc 1-6,} selektinler glycoconjugate ^ligandlar 6-9 ^ligandlar 10-13, homotypical kaderin ^{bağlama 14,} peptid ana histokompatibilite ^{kompleksleri 15} ile T hücre reseptör ve coreceptor integrinler Fcγ reseptörleri etkileşim ile onaylanmıştır ^19.

Yöntemi, microtopology ⁵ membran, membran çapa ^2, moleküler oryantasyon ve uzunluğu ^6, taşıyıcı sertlik ^9, eğrilik ²⁰ ve sıkışma kuvveti ^20, yanı sıra biyokimyasal faktörler gibi biyofiziksel faktörler, 2D kinetiği düzenlemeleri ölçmek için kullanılan etkileşen moleküllerin bulunduğu iskeleti ve membran mikroçevresinin ve bu moleküller ^15,17,19 yüzey örgütü, modülatörler gibi.

Bu yöntem t da kullanılır olmuşturo, değiştirilmiş bir ^modelini 21 kullanarak çift reseptör-ligand ^türleri 3,4 aynı anda bağlama, ^ve 19 trimolecular etkileşimleri çalışma .

Yöntemin en büyük avantajı, kendi ana membran ortamda reseptörlerinin çalışma izin vermesidir. Saflaştırılmış reseptörleri ¹⁷ kullanılarak elde edilen sonuçlar çok farklı olabilir. Ayrıca reseptör-ligand etkileşimleri de tipik biyokimyasal yöntemlerin ötesinde zamansal çözünürlüğe sahip bir alt-ikinci ölçeğinde çalışma sağlar.

Mikropipet yapışma frekans yöntemi göstermek için, α _L β ₂ etkinleştirmek için çözüm dimerik E-selektin ile nötrofil bağlayıcı eritrositlerde integrin α _L β ₂ Fonksiyonlu hücrelerarası adezyon molekülü 1 (ICAM-1) kinetik ölçüm göstermektedir.

Protokol

1. Tam kan eritrosit izolasyonu

1. EAS-45 çözümleri hazırlayın. Tablo I tüm malzemeyi tartılır ve 100-200ml DI su içinde çözülür. 1000ml çözüm yapmak ve 8.0 pH ayarlamak için su ekleyin. 50ml Filtre ve kısım. Saklama için -20 ° C'de dondurun.

Not: Adım 1.2 Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmış protokol ile, bir hemşire olarak, eğitimli bir tıbbi profesyonel gibi olmalıdır.

2. , EDTA içeren bir 10ml tüp içine medyan kübital venden kan 3-5ml çizin ve hemen EDTA ile kan hafifçe karıştırın ve iyice pıhtılaşmasını önlemek.
3. Süreç kan örneği mümkün olan en kısa sürede. Santrifüj dışında tüm aşağıdaki adımları hazırlık steril tutmak için kaputun altında yapılmalıdır. 50ml santrifüj tüpüne kan transferi 5dk @ 1000rpm, 4 ° C soğuk ve steril 1077 Histopaque ve santrifüj 10ml eklemek Iki kez tekrarlayın.
4. 10 ekleml soğuk ve steril PBS, 5min @ 1000rpm için santrifüj, 4 ° C Süpernatantı. 4 kez toplam 5 kez tekrarlayın.
5. Iki kez steril EAS-45 (5 dk @ 1000rpm, 4 ° C) yıkayın. Çamaşır hareket eritrositlerde, yeni steril bir 15ml tüpe son sırasında.
6. Süspanse edin eritrositlerde in10ml EAS-45.

2. Eritrositlerde biyotinilasyon

1. Adım 1 eritrositlerde tüp alın. 5min @ 1000rpm, 4 ° C için santrifüj sonra tüm süpernatantı Her biri için birkaç flakon eritrositlerde pelet 10μl koyun ve her flakon PBS karşılık gelen miktarı (örneğin altı farklı eritrositlerde biyotinilasyon konsantrasyonlarda hazırlanması Tablo II).
2. Tablo II göre taze Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 dilüsyonları olun.
3. Her flakon 0.1M borat tampon 10μl ekleyin.
4. Hemen hesaplanan her flakon biotin çözüm miktarı (Örnek olarak bkz. Tablo II) ve vorteks ekleyin .
5. Her RBC flakon yerleştirin.50ml konik bir tüp ve oda sıcaklığında 30 dakika rotator üzerinde inkübe içinde.
6. 2min @ 2000rpm EAS-45 800μl her flakon 3 kere yıkayın.
7. EAS-45 4 Her flakon ve saklamak için 100μl ekle ° C Nihai çözüm her 1μl eritrositlerde ~ 1mln olmalıdır.

3. Eritrositlerde biotin bağlantılı ligandlar * Functionalizing

1. 2mg/ml streptavidin çözüm üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Aliqouted çözümü, -20 ° C'de saklanabilir
2. Hemen streptavidin çözüm, girdap adım 2.7 (10μl) eritrositlerde eşit miktarda karıştırın ve 30 dakika için 4 rotator üzerinde inkübe ° C
3. 2min @ 2000rpm EAS-45 500μl ile 3 kere yıkayın. 15μl EAS-45 / depolama için% 1 BSA ekleyin.
4. 20μg/ml ligand çözüm, girdap adım 3.3 (10μl) hemen eritrositlerde eşit miktarda karıştırın ve için rotator oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
5. , 500μl ile iki kez yıkayın EAS-45 / 1% BSA 2dk @ 2000rpm. Depolama için EAS-45 / 1% BSA 15μl ekle.

* Protein biotin bağlantı varsa protein biyotinilasyon için ticari kitler mevcuttur birini (örneğin, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS PEG4 biyotinilasyon Kit) kullanımı ya da gösterildiği gibi bir ara adım olarak biotinlenmiş yakalama antikorlar video.

4. Reseptörü ve ligand yoğunlukları Kantitasyonu

1. Doyurarak konsantrasyonları ile ilgili mAbs farklı bir flakon, reseptör taşıyan hücrelerin oda sıcaklığında 30 dakika için, adım 3 ligand kaplı eritrositlerde inkübe. Ayrı şişeleri hücrelerinde kontrolü için alakasız izotip-uyumlu antikorlar ile inkübe edin. Birincil antikorlar floresan etiketli değilse, üreticinin talimatlarına göre floresan-konjuge sekonder antikor ile inkübe edin.
2. Ilgili floresan cal akış cytometery adım 4.1 'de hazırlanan numunelerin analizkullanılarak tespit boncuk. Şekil yoğunluklarını hesaplayınız. 1.

5. Mikropipet ve hücre odası için hazırlık

1. PN-30 Narishige 'Manyetik Cam Mikroelektrod Yatay Çektirme veya Sutter Aletleri Mikropipet Çektirme kullanarak kılcal tüpler mikropipetler çekin.
2. Microforge ile mikromanipülatör çekti mikropipet ucu istenen boyutta (genellikle 1-5μm gerekli çap aralıkları çalışmada kullanılmak üzere hücrelerin büyüklüğüne göre) ayarlamak için kullanın.
3. Istediğiniz boyuta Mikroskop Kapak Cam keserek hücre odasına hazırlayın. Deneme sırasında ozmolarite değiştirmek için orta buharlaşmasını önlemek için her iki tarafın Madeni Yağ haznesi Seal.
4. Reseptör-ligand taşıyan hücreleri odasına ekleyin.

6. Mikropipet yapışma frekans tahlil

1. Ilgili pipetler etkileşim hücreleri aspire ve bilgisayar programlı piezoelectr ic çevirmen kontrollü temas alanı ve süresi ile diğer hücre ile temas içinde ve dışında RBC sürücü. Hücre ayrılması üzerine RBC uzama gözlemleyerek yapışma olayları algılama.
2. Belirli bir temas süresi, temas retraksiyon döngüsü 50-100 kez tekrarlayın. Excel elektronik tablonun bir sütununda herhangi bir yapışma için yapışma ya da "0" için "1" ekleyerek gözlenen yapışma olayları kaydedin. Mikroskobik görüntüler için, örneğin, dijital medya ve video kaset kayıt cihazı kullanabilirsiniz.
3. Yapışma frekansı karşı temas süresi eğrisi ortalama ve SEM elde etmek için her bir temas süresi için en az üç farklı hücre çiftleri kullanarak kaydedin.
4. Kendi özel fonksiyonel abluka mAbs kullanarak ligandlar veya reseptörlerini bloke ilgisiz ligandlar (örneğin BSA) ve / veya kaplanmış eritrositlerde kullanarak kontrol için nonspesifik bağlanma eğrisi kaydedin. , Her temas süresi noktasında spesifik adezyon frekans nonspesifik yapışma ^frekansı 1 çıkarılması ile hesaplanır .

ove_title "> 7 Veri analizi

1. Fit özel yapışma frekansı P ileriye ikinci mertebeden ve birinci dereceden reseptörlerinin tek bir türün ve ligandlar ¹ tek bir türün arasında ters, tek adım etkileşimi açıklayan olasılıksal bir model (Denklem 1) karşı temas süresi t veri :
   
   _K 2B etkili afinitesi, k _off off hızı, m _r ve m _l 4. adımda ölçülen ilgili reseptör ve ligand yoğunlukları vardır, ve _c iletişim alanıdır. _Eğri-fit, c ve K etkili 2B afinitesi gibi aynı kefeye ve topluca olarak iki parametre, _A c _K a ve _k kapalı, vardır . Off oranı ile ürün etkin 2D oranı: c k = A _c K _x k _kapatır.
   Spesifik adezyon frekans _P çıkarma tarafından ölçülen toplam yapışma (P) ^1,21 _ölçülür nonspesifik yapışma fraksiyonu (P _nonspesifik) hesaplanır:
   

8. Temsilcisi Sonuçlar:

Integrin α _L β ₂ nötrofil sitesi yoğunluğu Şekil 1 Belirlenmesi. Nötrofiller ilk Rakamlar 3,4 veya E-selektin-Ig olmadan kullanılan deneysel durumu maç 10dk E-selektin-Ig 1μg/ml ile inkübe ve sonra PE-konjuge anti doyurarak konsantrasyonları (10μg/ml) -insan CD11a mAb (Klon HI111, özel Tablo bakınreaktifler ve ekipman) veya kontrol için alakasız fare IgG1, yıkanmış ve hemen analiz. Numuneler standart QuantiBRITE PE kalibrasyon boncuk BD LSR akış sitometresinde okundu. Panel A, E-selektin-Ig tedavi (mavi renk) veya tedavi edilmemiş hücreleri (yeşil renkli) ile birlikte kalibrasyon boncuk floresan histogramları (pembe) gösterir. Özel CD11a mAb boyama katı eğrileri ve ilgisiz izotip eşleştirilmiş kontrol antikor boyama, noktalı eğriler gösterilmiştir gösterilmiştir. E-selektin-Ig (tüm yıkama adımları ve FACS tampon varlığı) ile muamele edilen hücreler CD11a yoğunluğu tedavi edilmezse hücreleri ile karşılaştırıldığında görüldüğü gibi etkilemedi. Panel B yoğunluğu nicelikleme süreci gösterir. Log10 Masası'nda dört kalibrasyon boncuk histogramlar her tepe değeri ortalama floresan yoğunluğu (FI) için hesaplanmıştır (pembe daireler) ve boncuk başına çok özel PE moleküller için (üretici). Log10 fluoresc karşı boncuk başına Log10 PE moleküllerin lineer regresyonence çizilen oldu. E-selektin ile tedavi edilen hücreler için respectivly 3.99 (mavi katı daire) ve 2.23 (açık mavi daire), özel mAb ve kontrolü antikor, eşit Log10 FI (y ) değerleri. Biz x (değerler Panel B, yeşil ve mavi daireler olarak çizilir) lineer denklem çözüldü x = Log10 PE / PE olarak hücre ve:, nötrofil α _L β ₂ toplam sayısı mAb oranı 1:1 idi. 9587 olarak hesaplanmıştır. Yüzey yoğunluğu, nötrofil ^çapı 22 olarak 8.4μm kullanarak, 43 moleküller / ^mm 2 olarak hesaplanmıştır . ICAM-1 Yoğunluk benzer 65 mol / mikron ² egale PE-anti-insan CD54 mAb kullanılarak akış cytometery ölçüldü.

Şekil 2 Mikropipet sistem şemaları. Bizim mikropipet ev sistemi monte edilmiş ve üç alt sistemlerin oluşan bir görüntüleme alt sistemi bir rec gözlemlemek için izinord ve analiz mikropipet aspire hücre hareketleri, bir hücre odasından hücreleri seçmek için etkinleştirmek için bir mikromanipülasyon alt sistemi, bir basınç alt sistemi bir mikropipetler hücreleri aspire için izin vermek. Görüntüleme alt sistemi merkezi bir 100x immersiyon yağı NA 1.25 amacı ile parça (Olympus IMT-2 IMT2) mikroskop ters. Görüntü, bir şarj çift cihazı (CCD) kamera ile bir video kaset kaydedici gönderilir. Video zamanlayıcısı zaman takip sistemi ile birleştirilir. Her mikropipet mikroskop üzerine monte edilir ve üç eksenli hidrolik mikromanipülatör yerleştirilmiş ince mekanik bir sürücü tarafından manipüle edilebilir. Newport Mekanik manipülatörler de kullanılabilir. Mikropipet sahiplerinden biri, bir piezoelektrik çevirmen üzerine monte edilmiş, sürücü piezo aktüatör için gerilim yükseltici (ev yapımı) ile, bir bilgisayar LabView kodu (istek üzerine) ve DAQ kurulu aracılığıyla sinyal çevirir tarafından kontrol edilir. Bullows bir pipet, tam bir yapışma test döngüsünde ve repeatably taşımak için. Basınç regülasyonu alt sistemi deney sırasında emme kontrol etmek için kullanılır. Hidrolik hat mikropipet tutucu bir sıvı rezervuar bağlanır. A fine mekanik pozisyoner rezervuar yüksekliği tam olarak değiştirilmesine olanak sağlar.

Mikropipetler KIMAX erime noktası borosilikat cam kapiller tüplerin (dış çapı 1.0 ± 0.07 mm ve iç çapı 0.7 ± 0.07 mm kullanılarak üretilir. Birincisi, kılcal tüpler mikropipetler PN-30 Narishige 'Manyetik Cam Mikroelektrod Yatay Çektirme kullanarak çekti. (Sutter Aletleri Mikropipet Çektirme başka bir seçenek çektirmesi) İkincisi, Microforge sistemi (dahili evde) istediğiniz boyuta açılış mikropipetler kesmek için kullanılır. Microforge sistemleri Ticari modelleri de mevcuttur.

Microsc deney sırasında mikropipetler titreşim önlemek içinyerdir, mikromanipülatörler ile birlikte, bir havalı süspansiyon masaya yerleştirilir.

Şekil 3 _i için yapışma frekans F Koşu özgü (A) ve nonspesifik (B) 1s (kırmızı) bağlayıcı ve 10s (mavi), ICAM-1 (A) veya hIgG ile kaplı eritrositler arasında tekrarlanan yapışma test döngüsü ölçülen temas süresi ( B ) insan nötrofil ifade integrin α _L β ₂ F ₌ (X ₁ + X ₂ + ... + _X) / i (1 i test döngüsü indeksi ≤ i ≤ n), X _i "1" eşittir (yapışma) veya "0" (yapışma) F _n (n = 50) yapışma olasılığı için en iyi tahmini olarak kullanılmıştır.

Şekil 4 KinetiğiICAM-1 nötrofil integrin α _L β ₂ bağlama ( .) Ölçülen Yapışma olasılık her temas süresi üç hücre çiftleri için Şekil 3'te gösterildiği gibi ortalama ve temas süresi karşı çizilmiştir. Odanın orta 1mm her Ca ^{2 +} ve Mg ^{2 +} dimerik artı 1μg/ml E-selektin-Ig ile α _L β ₂ bağlama upregüle HBSS oldu. Eritrositler üzerinde ICAM-1-Ig yakalamak için bir ara adım eritrositlerde streptavidin inkübasyon adımdan sonra 10μg/ml yakalama antikor (biotinlenmiş keçi anti-insan Fc antikoru, eBioscience) ile inkübe eklendi. Nonspesifik bağlayıcı iki farklı koşullar için kontrol etmek için kullanılır: 1) eritrositler ile kaplı değil, anti-insan-Fc yakalama antikoru ile kaplı ve eritrositler için bağlayıcı ICAM-1-Ig (O) ve 2) nötrofil yerine insan IgG ile inkübe (Δ) antikor yakalamak. 10μg/ml insan IgG E bağlayıcı en aza indirmek için orta eklendiRBC yüzeyinde yakalama antikor çözüm-selektin-Ig. Insan IgG kontrol eğrisi olarak kaydedilen Nonspesifik bağlama, belirli bir yapışma olasılığı eğrisi (elde etmek için kullanılan ) Denk. 2. Denklem Montaj özel yapışma olasılığı eğrisi. 1 (düz çizgi) etkili afinitesi _c K = 1.4 • 10 ^-4 μm4 ve k _off = 0.3 s ^-1 döndü.

Reaktif	MW (g / mol)	Konsantrasyon (mM)	Miktarı (g)
Adenin	135,13	2	0,27
D-glikoz (dekstroz)	180,16	110	19,82
D-Mannitol	182,17	55	10,02
Sodyum Klorür (NaCl)	58,44	50	2,92
Sodyum Fosfat, Dibazik (Na HPO )	141,95	20	2,84
L-glutamin	146,15	10	1,46

(Tablo 1). EAS-45 tampon hazırlığı (1L ).

DMF 550 ul 25 mg Biotin-XHS	0.1M biotin çözümü
0.1 biotin w / DMF 01:10 seyreltme	0.01m biotin çözümü
0.1 biotin w / DMF 1:100 seyreltme	0.001M biotin çözümü

Tablo 2 biotin çözümün hazırlanması.

biotin final konsantrasyon (mcM)	4	10	20	50	100	160
Eritrositlerde pelet stoku (ul)	10	10	10	10	10	10
1x PBS (ul)	179,2	178	176	179	178	176,8
0.1M borat tamponu (ul)	10	10	10	10	10	10
0.01m biotin çözümü (ul)				1	2	3,2
0.001M biotin çözümü (ul)	0,8	2	4

Tablo 3 eritrositlerde biyotinilasyon.

Tartışma

Biri, bazı kritik adımları düşünmelisiniz mikropipet yapışma frekans testinin başarılı bir şekilde kullanın. Birincisi, faiz reseptör-ligand sistemi için spesifik etkileşim kayıt emin olun. Nonspesifik kontrol ölçümleri (bkz. Şekil 3, 4) özgüllük sağlar. İdeal olarak, nonspesifik yapışma olasılıkları tüm temas süresi süreler için 0.05 altında olmalı ve her zaman noktası için spesifik ve nonspesifik yapışma olasılıklar arasında anlamlı bir fark var. Çift eritrosit yüzey ligandlar için farklı yöntemler kullanılabilir. Bu ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog #	Yorumlar
10x PBS	BioWhittaker	17-517Q	Kullanmadan önce 1x deiyonize su ile seyreltilir
Vacutainer EDTA	BD	366643	Eritrosit izolasyonu
10ML PK100
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	Eritrosit izolasyonu
Adenin	Sigma-Aldrich	A2786	EAS-45 hazırlık
D-glikoz (dekstroz)	Sigma-Aldrich	G7528	EAS-45 hazırlık
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	6360	EAS-45 hazırlık
Sodyum Klorür (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	EAS-45 hazırlık
Sodyum Fosfat, Dibazik (Na & # x2082; HPO ₄)	Fisher Scientific	S374	EAS-45 hazırlık
L-glutamin	Sigma-Aldrich	G5763	EAS-45 hazırlık
Biotin-X-NHS	Calbiochem	203188	Eritrositlerde biyotinilasyon
Dimetilformamid (DMF)	Thermo Scientific	20673	Eritrositlerde biyotinilasyon
Borat Tampon (0.1M)	Elektron Mikroskopi Bilimleri	11455-90	Eritrositlerde biyotinilasyon
Streptavidin	Thermo Scientific	21125	Functionalizing Ligand
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	Functionalizing Ligand
Quantibrite PE boncuklar	BD Biosciences	340495	Yoğunluk kantifikasyon
Akış sitometresi	BD Immunocytometry Sistemleri	BD LSR II.	Yoğunluk quanldirimi
Kılcal Tüp 0.7-1.0mm x 30 "	Kimble Cam A.Ş.	46485-1	Mikropipet çekerek
Madeni Yağ	Fisher Scientific	BP2629-1	Odası montaj
Mikroskop Kapak Camlar	Fisher Scientific	12-544-G	Odası montaj
PE α-insan CD11a Klon HI 111	eBioscience	12-0119-71	Şekil 1 için kimyasalı
PE anti-insan CD54	eBioscience	12-0549	Şekil 1 için kimyasalı
Fare IgG1 İzotip Kontrol PE	eBioscience	12-4714	Şekil 1 için kimyasalı
hidrolik mikromanipülatör	Narishige	MO-303	Mikropipet sistemi
Mekanik manipülatör	Newport	461-xyz-m, SM-13, DM-13	Mikropipet sistemi
piezoelektrik tercümecisi	Physik Instrumente	P-840	Mikropipet sistemi
LabVIEW	National Instruments	Sürüm 8.6	Mikropipet sistemi
DAQ kurulu	National Instruments	USB-6008	Mikropipet sistemi
Optik tablo	Kinetik Sistemleri	5200 Serisi	Mikropipet sistemi