Bu yazıda son derece parallelizable şekilde tek bir molekül düzeyinde enzimatik proteolizin yürürlüğe etkisini incelemek için manyetik cımbız kullanımı açıklanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri
Bu makalede
Özet
Özet
Mekanik güçlerin üretme ve algılama kanser metastazı 1, aterogenez 2 ve 3 yara iyileşmesi ile doğrudan ilgili olan, hücre fizyolojisi her yerde görülen bir yönüdür. Bu örneklerin her birinde, hücreler çevreleri üzerinde kuvvet uygularlar ve aynı enzimatik remodel ekstraselüler matriks (ECM) hem de. ECM kuvvetlerin etkisi böylece 4-7 büyük olasılıkla onun biyolojik ve tıbbi önemi nedeniyle önemli bir ilgi alanı haline gelmiştir.
Gibi optik tuzaklama 8, atomik kuvvet mikroskobu 9, ve manyetik cımbız 10,11 olarak tek bir molekülün teknikleri araştırmacılar bireysel proteinler üzerinde kuvvetleri uygulayarak moleküler düzeyde enzim fonksiyonu soruşturma için izin. Bu tekniklerin, manyetik cımbız (MT) Düşük maliyet ve yüksek verimlilik için dikkat çekicidir. MT ~ 1-100 pN aralığında kuvvetleri uygulamak ve milisaniye zamansal çözünürlük sağlayabilir,ayrıca tek moleküllü seviyesi 12 az enzim mekanizmasının çalışma eşleştirilir nitelikleri. Burada tek bir protein moleküllerinin proteoliz tarihinde yürürlüğe etkisini incelemek için son derece parallelizable MT tahlil raporu. Bu matris metalloproteinaz 1 (MMP-1) tarafından bir trimeric kolajen peptid proteolizin spesifik bir örnek sunmak; Bununla birlikte, bu tahlilde kolayca diğer substratlar ve proteazlar incelemek için adapte edilebilir.
Protokol
1. Akış Hücre Hazırlık
- Lamelleri (# 1.5, 22x22 mm ve 22x40 mm, VWR) sonication kullanılarak temizlenir.
- Lamelleri tutarak ve (bkz: adım 2) sonikatör uyum gösterme yeteneğine sahip küçük bir cam kaba lamelleri ekleyin.
- Izopropanol ile kabın doldurmak ve 20 dakika boyunca bir banyo içinde sonikatör ses dalgalarına maruz.
- Izopropanol atın ve bir Barnsted MilliQ aparatı veya benzer bir cihaz tarafından üretilen deiyonize bol su ile lamelleri durulayın. Su kabı doldurun ve 20 dakika boyunca ses dalgalarına maruz.
- Sonikasyon sonra, filtrelenmiş ve tozsuz bir hava akımı içinde lamelleri kurutun. (Yani hiçbir leke) temiz görü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, klasik bir tek bir molekül tekniği için yeni bir kullanımını açıklar. Manyetik cımbız, bir maliyet-etkin şekilde yüksek verimli tek bir molekül testleri orta sağlar. Ancak, tüm deneysel teknikler gibi zorluklar ve potansiyel tuzaklar vardır.
Manyetik cımbız Sınırlamalar
Optik bir tuzak ile karşılaştırıldığında MT aygıtının mekansal ve zamansal çözünürlüğü düşük. Bundan başka, burada açıklanan basit MT tarafından üretilen kuvvetleri rutin AFM deneylerde .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma Bilimsel Arabirimi (ARD), NIH Direktörü Yeni Yenilikçisi Ödülü Programı çerçevesinde Ulusal Sağlık Enstitüleri 1-DP2-OD007078 (ARD), William Bowes Jr Stanford Yüksek Lisans Bursu (ASA de Burroughs Wellcome Kariyer Ödülü ile desteklenmiştir ) ve Stanford Kardiyovasküler Enstitüsü Younger predoctoral Bursu (JC). Yazarlar mikroskopi ekipman loaning James Spudich teşekkür ederim.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog Numarası | |
| Mikro Kapak Cam # 1.5 (22x22) | VWR | 48366-067 | |
| Mikro Kapak Cam # 1.5 (22x40) | VWR | 48393-048 | |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 | |
| T4 DNA ligaz | Invitrogen | 15224-041 | |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 | |
| Anti-digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
| Anti-myc Antikor | Invitrogen | 46-0603 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| p-Aminophenylmercuric asetat | Calbiochem | 164610 | |
| Biotin-maleimid | Sigma Aldrich | B1267 | |
| Biotin oligo etiketli | IDT DNA | Özel sentezi | |
| Digoxigenin oligo etiketli | IDT DNA | Özel sentezi | |
| Kollajenpeptid gen | DNA 2.0 | Özel sentezi | |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plazmid Veritabanı | ||
| z-çevirmen | Thorlabs | MTS50 | |
| Çevirmen için servo kontrol | Thorlabs | TDC001 |
Kaynaklar
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
