Solid-state Nanopores ile izlenmesi Protein Adsorpsiyon

Özet

Inorganik bir yüzeye proteinlerin non-spesifik adsorpsiyon izlemek için solid-state nanopores kullanarak bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak ve tek-molekül düzeyinde probed olması adsorpsiyon için izin, rezistif-pulse prensibi kullanmaktadır. Tek bir protein adsorpsiyon süreci denge noktasından uzak olduğu için, kantitatif protein adsorpsiyonu sabit görünen birinci dereceden reaksiyon hızı belirlenmesi yanı sıra ve Langmuir adsorpsiyon sabit sağlayan sentetik nanopores paralel diziler istihdam teklif.

Özet

Solid-state nanopores tek-molekül düzeyinde, nükleik asitlerin yapısını ve ^{esnekliğini 1-6, proteinler} 7 açılımına ve değişik ^ligandlar 8 afinitesi incelemek için ölçümler yapmak için kullanılmaktadır . ^9-12 rezistif-pulse tekniği bu nanopores kaplin, bu ölçümler çok çeşitli koşulları altında ve etiketleme ³ için gerek kalmadan yapılabilir. Rezistif-pulse tekniği, iyonik bir tuz çözeltisi nanopore iki tarafta tanıtıldı. Bu nedenle, iyonlar, sürekli bir akım uygulanan bir transmembran potansiyel odasının bir tarafı diğerine tahrik edilmektedir. Nanopore içine bir analitin bölümleme, tek-molekül bilgileri ayıklamak için analiz edilebilir, bu akımı iyi tanımlanmış bir sapma neden olur. Bu tekniği kullanarak, nanopore duvarlara tek proteinlerin adsorpsiyon geniş bir yelpazede altında izlenebilirkoşulları ^13. Mikroakışkan cihazların boyutu küçültmek gibi, bu sistemlerin tek proteinleri ile etkileşimi bir endişe olur çünkü protein adsorpsiyonu, önemi de büyüyor. Bu protokol, diğer ince filmler, nanopore delme mükellef veya Fonksiyonlu nitrür yüzeylere kolayca uzatılabilir nitrür filmler, bağlayıcı protein için hızlı bir tahlil açıklamaktadır. Proteinlerin çeşitli geniş bir yelpazede çözümler ve denatüre koşulları altında incelenebilir. Ayrıca, bu protokol nanopore spektroskopi kullanarak daha fazla temel sorunları keşfetmek için kullanılıyor olabilir.

Protokol

1. , Silisyum nitrür membranlar solid-state nanopores üretimi

1. 200 kV bir ivme gerilimi FEI Tecnai F20 S / TEM getirin. Farklı bir S / TEM kullanıyorsanız, ivme gerilimi 200 kV ⁹ eşit veya daha büyük olmalıdır
2. 20 nm kalınlığında SPI silisyum nitrür pencere ızgara TEM numune tutucu içine yerleştirin ve 30 saniye boyunca oksijen plazma ile temiz sahibinden herhangi bir kirleri çıkarmak için.
3. S / TEM örnek Yük ve aşağı pompa vakum izin verir. S / TEM vakum aşağı pompalanır sonra, parlak bir kare için Ronchigram bakarak aydınlık alan TEM modu nitrür penceresi bulabilirsiniz. TEM düzgün takıldığından emin olun, sonra hizaya getirin ve örnek odaklanma.
4. S / TEM KÖK moduna geçin. Örnek görüntü HAADF (veya eşdeğer) detektörü kullanın ve düzgün takıldığından emin olun.
5. Monokromatör düşük bir değere ayarlayın. Monokromatör daha düşük bir değer daha yüksek bir para birim sağlardelme için elektron t. S / TEM Monokromatör yoksa, bu adımı görmezden gelebilirsiniz.
6. Nanopore sondaj için uygun bir nokta boyutunu seçin. Bu elektron prob çapı karşılık gelir. 3 nm prob 5 nm çaplı gözenekler delmek için iyi çalışır. Büyük bir prob (5 nm) daha hızlı delme ve daha büyük bir gözenek yaratacaktır. Küçük bir prob (1 nm) daha küçük bir gözenek matkap ve oluşturmak için daha uzun sürer.
7. Gerekirse, KÖK hizalanmalar ayarlayın.
8. Odak nitrür membran ve x1.3M bir büyütme getirmek. Güzel odaklama Ronchigram izleme yapılmalıdır.
9. Örnek herhangi bir hareket varsa, o örnek stabilize etmek için bekleyin. Bu bir saat kadar sürebilir. Elektron ışını nitrür zarar vermemek için beklerken boş.
10. Örnek üzerinde elektron prob ve sondaj başlayın.
11. HAADF dedektörü ile tarayarak periyodik olarak numune kontrol, hem nanopore dri ediliyor emin olunlled (karanlık bir nokta gibi görünecek) ve örnek bir hareket olup olmadığını kontrol edin. Örnek biraz sürükleniyor, nanopore üzerinde elektron prob konumunu ayarlamak.
12. Gözenek oluşturmuştur tanımlamak için Ronchigram izleyin. Odak, nitrür filmi ışıltılı bir görünüme sahiptir. Bu zaman nanopore formları kaybolur. Biraz odak dışı Ronchigram koymak nanopore ile ilişkili bir Fresnel saçak görmek için izin verir.
13. HAADF nanopore bir görüntü çekin.
14. Nanopore görüntünün bir yoğunluk profili yapın. Nanopore çapı profil karanlık bölgeye göre tahmin edilebilir.
15. Nanopore Genişleme elektron prob gözenek kenarları boyunca hareket ettirerek yapılabilir.
16. Nanopore istenilen çapı sonra, TEM moduna S / TEM koymak.
17. Monokromatör boyutu onaylamak için aydınlık alan TEM kullanarak, standart belirleme ve görüntü nanopore getirin

2. Solid-state nanopore, Islatma

1. De-gaz içeren 1 M KCl, 10 mM potasyum fosfat, pH 7.4 de-iyonize su. Bu, vakum altında çözümler koyarak ve 20 dakika boyunca banyo sonikatör yerleştirerek yapılabilir.
2. 10 ml Pyrex behere nanopore içeren silisyum nitrür çipi yerleştirin. Çok hassas olduğu gibi nitrür penceresi kırmamaya özen gösterin. Davlumbaz ocak behere koyun ve 100 ° C'ye kadar ayarlı
3. Nanopore çip piranha çözümü ile büyük bir özenle kullanarak temizleyin. Önce cam bir pipet kullanarak konteyner 3 ml sülfürik asit ekleyin. Sonra, dikkatle piranha çözüm ¹⁴ yapmak için 1 ml sülfürik asit, hidrojen peroksit ekleyin. Lütfen tüm tedbirleri almak.
4. Nanopore çip piranha çözüm emmek için 10 dakika izin verin.
5. Piranha çözüm cam bir pipet kullanarak kaptan çıkarın. Uygun bir depolama yuvasına yerleştirin.
6. Fitemiz bir cam pipet kullanarak de-gaz verilerek, de-iyonize su ile beher ll. Boş su beher ve en az 5 kez tekrarlayın.
7. Temiz bir cımbız ile nanopore çip ışık emme çıkarın ve kurulayın
8. Hemen nanopore odası (Şekil 2a, 2b) içine çip mühür, O-ring veya silikon çip odasında güvenli olabilir .
9. Odanın KCl çözeltisi ile doldurun
10. Odası (Şekil 2b) Ag / AgCl elektrot bağlayın. Elektrotlar gece çamaşır gümüş tel iliklerine tarafından yapılabilir.
11. Elektrotlar arasında bir transmembran potansiyeli uygulayın ve voltaj-klemp modunda bir Axon 200B patch-kelepçe amplifikatör kullanarak geçerli bir yanıt monitör.
12. Ölçümlerden bir I / V (akım-gerilim) eğrisi oluşturun. 1 M KCI (Şekil 3) kullanarak I / V eğrisi son derece doğrusal olmalıdır. Nanopore iletkenlik çapına uygun olmalıdır. Nanopore görünmüyorsadoğrusal I / V eğrisi, iletkenliği çok düşük, ya da nanopore açık akım sabit değildir (Şekil 4a), düzgün nanopore ıslatılmış ve piranha yıkama tekrar edilmelidir anlamına gelir.

3. İzleme protein adsorpsiyonu

1. Bu protein örneği olmayan tampon koşulları ile şimdiki izlemek için bir tek nanopore membran veya nanopores paralel dizi (aşağıya bakınız) ile kontrol deneyleri gerçekleştirmek için büyük önem taşımaktadır. Biz aşağıdaki iki adımları uygulamanızı öneririz: (i) yüksek saflık düzeyinde bir tampon kullanımı (saflık>% 99.9; kromatografisi-sınıf düzeyi), ve (ii), etkileşim, solid-state nanopore bir tampon kullanımı değildir tek kanallı olaylarını üretir. Buna ek olarak, yüksek saflıkta protein örnek standart protein kimyası prosedürleri kullanarak elde öneriyoruz. Protein örnek saflığı sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel (SDS-PAGE) analizi ve yüksek çözünürlüklü ma tarafından kontrol edilmelidirss spektrometresi ^15.
2. Topraklı banyo odasının içine incelenecektir arıtılmış örnek protein ekleyin. Banyo boyunca diffüz örnek için zaman tanıyın. McM aralığı ^7,15-21 nM onlarca tipik protein konsantrasyonu ölçülebilir.
3. Toplam çalışılan protein ücretten polarite tam tersi olan bir transmembran potansiyel gerilim önyargı uygulayın. Örneğin, BSA, pH 7.4 'de etkili bir net negatif yük vardır ve bu nedenle pozitif bir gerilim önyargı uygulanmalıdır. Uygulanan gerilim zıt güçler tarafından tahrik olacak, karşılıklı suçlamaların nanopore iç ve proteinlerin içinde potansiyel degrade oluşturur. Nanopore proteinler sürücü sadece gerilim polarizasyona ölçülebilir sinyalleri yaratacaktır.
4. Uygulanan potansiyeli 200 mV büyüklükte bir çok protein analitler gözlemlemek için yeterli büyüklükte olması gerekir. Etkinlikler temel (Şekil 4b) geçici akım deplasmanlar gibi görünecektir.Hiç sinyal görülürse, oda protein konsantrasyonu artırır. Yüksek gerilimler için sinyal gürültü oranını iyileştirir. Nitrür nanopores birkaç volt dayanabilir.
5. Protein Adsorpsiyon, uzun ömürlü, nanopore (Şekil 4c) temel akımı değişiklikleri gibi görünecektir.

4. Nanopores işlevsellik için Olanakları

Silisyum nitrür ^22,23 fonksiyonel gruplar uygulamak için çeşitli yöntemler mevcuttur. Nitrür filmlerin çoğu ince bir oksit tabakası, dış ve ozon maruz kalma, gerekirse ek bir oksit tabakası oluşur. Farklı organosilanes katmanlar üzerine kullanılan ve kendi kendini monte edilebilir. Özellikle ilgi çekici olan, aminosilane organik yüzeylerin bir dizi inceleme için izin, öz-montaj ve daha fazla (yani, karboksilik asit ve aldehit) modifiye edilebilir. Nanopore piranha ile yıkanır ve Chambe emniyete sonrar, amin odasının banyosuna 0.5 M TBACl (tetrabutylammonium) ve çözücü olarak kullanılan susuz MeOH (metanol) destekleyici bir elektrolit ile direkt olarak ilave edilebilir. Monolayer oluşumu, 400 mV gerilim önyargı ve cereyanı ²³ ölçüm uygulama tarafından takip edilebilir.

5. Belirgin birinci dereceden reaksiyon hızı sabit belirlenmesi ve paralel nanopore dizileri kullanarak sabit Langmuir adsorpsiyon

5.1 absorpsiyon ve desorpsiyon için belirgin birinci dereceden reaksiyon hız sabitleri

Biz bu metodoloji olumlu yönü tek-molekül düzeyinde bireysel Adsorpsiyon gözlemlemek kabiliyeti olduğunu vurgulamak. Protein adsorpsiyonu inorganik bir yüzeye tek-molekül ölçümleri kullanılarak solid-state nanopores paralel diziler kadar ölçeklendirilebilir. Nanopores paralel dizi güvenilir istatistik almak için tahlil birçok gözenekleri ihtiyacı nedeniyle gereklis Bu amaçla, bir nanopore dizi kullanımı, bireysel Adsorpsiyon izlenmesi yanı sıra, daha fazla analiz için birden fazla olaylar ölçümü sağlayacak. Yukarıdaki örnek sadece birden fazla delik delme protokolü tarafından oluşturulan silisyum nitrür nanopores bir dizi olabilir. Her nanopore benzer büyüklükte olmalıdır. 6x6 ya da 7x7 nanopores Diziler yeterli olmalıdır. Analit odasına protein ilavesi üzerine, mevcut aşağıdaki ifade ile, üstel bir şekilde çürümeye:

I _t = I _{∞ (∞} - I ₀₎ exp (-k 't)

Burada, ben _t, deneysel bir t zamanında mevcut gösterir. ₀ nanopore dizi üzerinden orijinal akım geçiyor. _∞ (yani sonsuz) doygunluk düzeyinde akımı gösterir. K 'görünürdeki birinci dereceden reaksiyon hızını sabit, inci tespit edilebilire deneysel eğrinin uygun. Büyük bir k 'daha hızlı bir adsorpsiyon oranı olarak yorumlanabilir. Bu oran I _∞ / I _0, aynı zamanda, normalize doyma akımı olarak adlandırılan 0 ve 1 arasında boyutsuz bir sayıdır. Bu parametre, adsorbe protein analitler doluluk bir ölçüsüdür. Bu nedenle, her farklı deneysel durum iki spesifik çıkış parametreleri I _∞ / ₀ ve k 'ile ilişkili olmalıdır.

Bu görünürdeki birinci dereceden adsorpsiyon hız sabitleri ve normalize akımları nanopores içindeki proteinler tarafından harcanan zamanı etkili etkilenen olduğunu belirtmek gerekir. Bu sefer toplu sulu faz ²⁴ protein analitlerin konsantrasyonuna bağlıdır. Bu nedenle, bu sayıların ek düzeltme nanopore iç içindeki proteinler tarafından harcanan zamanı etkili dayanarak uygulanması gerekmektedir. Biz sülfüroz frekans ölçüm öneririzt (translokasyon) ortalama ile çarpılması olaylar ve bu olayların bekleme süresi. Bu proteinlerin birim zamanda nanopore iç içinde harcanan ortalama süre verecek.

Desorpsiyon oranı sabit, hem de nanopores paralel bir dizi kullanılarak tespit edilebilir. Mevcut düzeyi en kısa sürede doygunluk (I _∞) ulaştığında, voltaj ters olmalı, o yüzden artık proteinler nanopores içine sıkışmış. Desorpsiyon bireysel proteinlerin büyük değerler doğru kaydedilen akımının değişmesi ile eşlik edecek. Hız sabiti, daha sonra mevcut seviyesinin yükselişi çıkarılan olacaktır.

Sabit 5.2 Langmuir adsorpsiyon

Nanopores inorganik yüzeyler üzerine protein analitlerin emme sulu faz protein konsantrasyonu bağlıdır. Bu olgu, zaten tek-molekül düzeyinde ¹³ gözlenmiştir. Θ temsil ediyorsa s normalize doyma akımı (I _∞ / I _0), daha sonra tipik bir Langmuir izoterm denklemi aşağıdaki ifade ile verilir :

C sulu faz protein konsantrasyonu. α Langmuir adsorpsiyon sabit. Bu sabit bir artış ile adsorpsiyon bağlayıcı enerji ve sıcaklık bir azalma ile artar. Θ veri toplama noktaları, sulu faz çeşitli protein konsantrasyonları yürütülen paralel diziler ölçümler istihdam sağlayacak . Veri büyüklüğü monte Langmuir adsorpsiyon sabit doğrulamak için diğer tekniklerle birlikte analiz edilmelidir. Buna ek olarak, tam atomlarla moleküler dinamik simülasyonları ^25,26 da, elde edilen deneysel veriler yorumlara yardımcı olabilir .

başlığı "> 6 Temsilcisi Sonuçlar

Solid-state nanopores için tipik sonuçlar aşağıdaki gibi olacaktır. Açık gözenek akımı Şekil de görüldüğü gibi, son derece kararlı olmalıdır. 4a. Nanopore I / V özellikleri 1 M KCl 10 Şekil görüldüğü gibi potasyum fosfat, pH 7.4, yüksek doğrusal olmalıdır. 2. I / V eğrisinin doğrusal bir uyum eğimi nanopore üniter iletkenlik sağlayacak. Iletkenlik nanopore çapı doğrudan bir ilişki vardır ve denklem uymalıdır: L, G nanopore iletkenlik, d çapı, uzunluğu ve ¹⁴ oda çözüm iletkenliği σ. Bu değer% 30 içinde eşleşmesi gerekir. Çok küçük ise, gözenek muhtemelen ıslatılmış değildir. Protein ilavesi ile, hızlı olaylar Şekil de görüldüğü gibi, birbirini takip gerekir. 4b. Protein adsorpsiyon Şekil görüntülenir, uzun ömürlü bir akım damla. 4c. Bazı proteinler çok dayanıksız ve gözenek iç içinde yapısal değişim geçirmiştir. Bu durumda, uzun ömürlü bir gerilim düşümü hızlı dalgalanmalar eşlik edecek.

Şekil 1 Tecnai F20 S / TEM kullanılarak üretilen Solid-state nanopore. Gözenek çapı 20 nm KÖK modunda açılmış. Görüntü aydınlık alan TEM modu alınmıştır. Nitrür 30 nm kalınlığında idi.

Şekil 2. Odası rezistif-nabız ölçümleri tek bir solid-state nanopore konut için kullanılır.) Odası ve serbest duran nitrür penceresi (TEM ızgara) ile bir silikon yongası. Nanopore yüklemeden önce nitrür içine delinmiş. Red O-ring, iyi bir s oluşturmak için kullanılır.iyonik çözüm iki hamam ayıran çip hakkında eal. B) odası nanopore açısından çözüm banyoları ve elektrot yerleştirme gösteren şematik.

Şekil 3 farklı çaplarda solid-state nanopores Tipik I / V izler. Tek kanallı elektrik izlerini 1 M KCl 20 mM Tris, pH 8.5 alınmıştır. 30 nm kalınlığında silisyum nitrür Nanopores delinmiştir. Not nitrür kalınlığı nanopore üniter iletkenlik etkileyecektir.

Şekil 4 tek kanallı mevcut izleri ve protein adsorpsiyonu algılama ölçülmüştür. A) 10 nm çapında nanopore açık gösteren bir tek kanal elektrik iz. B) Cari deplasmanlar arası (BSA), sığır serum albümin bölümleme temsilnanopore IOR. C) Adsorpsiyon BSA nitrür yüzeye. 1 M KCl 10 mM potasyum fosfat, pH 7.4 de aynı nanopore tüm izleri. Uygulanan transmembran potansiyeli +40 mV ve BSA 120 nM konsantrasyonda topraklı odasının banyosuna eklendi.

Tartışma

Solid-state yüzeyler üzerine ^27-29 protein spontan adsorpsiyon biochip uygulamaları ve fonksiyonel melez Biyomalzemelerin yeni bir sınıf tasarım gibi alanlarda bir dizi, temelde önemli. Önceki çalışmalar, solid-state yüzeylere adsorbe proteinler yatay hareketlilik veya önemli desorpsiyon oranlarının görünmüyor olduğunu göstermiştir ve bu nedenle protein adsorpsiyon genellikle nonspesifik ve geri dönüşü olmayan bir süreç ^30-32 olarak kabul edilir. Katı hal yüzeylerinden Protein adsorpsiyon, elektros...

Malzemeler

Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tecnai F20 S / TEM	FEI		S / TEM hızlandırma gerilimi ≥ 200kV ve saha emisyon kaynağı gerektirir.
TEM için 20 nm kalınlığında silisyum nitrür membran pencere	SPI	4163SN-BA
Akson Axopatch 200B patch-kelepçe amplifikatör	Moleküler Cihazlar
Akson Digidata 1440A	Moleküler Cihazlar
10 yazılım pCLAMP	Moleküler Cihazlar		Elektrofizyoloji Veri Toplama ve Analiz Yazılımı
Sülfürik Asit	Fisher Bilimsel	A300
hidrojen peroksit	Fisher Scientific	H325
Silikon O-ring	McMaster-Carr	003 S70	Alternatif PDMS kullanın
gümüş tel	Sigma-Aldrich	348759	Elektrotlar için
SPC: Teknoloji, D alt iletişim, pin	Newark	9K4978	Elektrotlar için
potasyum klorür	Sigma	P9541
potasyum fosfat dibazik	Sigma	P2222
potasyum fosfat tekbazlı	Sigma	P5379
PDMS	Dow Corning		Sylgar 184 Elastomer ayarlanır. Odasının yapmak için.
Kwik-Oyuncular Mastik	Dünya Hassas Aletler	Kwik-Cast	Hızlı hareket eden silikon
sıcak plaka	Fisher Scientific
Faraday kafesi