Yöntem makalesi

Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

13.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/3575

⸱

5 Kasım 2011

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Human Physiology and Clinical Experimental Research, Semmelweis University

Bu makalede

Özet

Biz kurmak nasıl göstermek In vitro Iskemi / reperfüzyon modeli ve nasıl postiskemik kalp hücreleri kök hücre tedavisinin etkisini değerlendirmek.

Özet

Kök hücre naklinin klinik pratikte 1,2,3 kendi yolunu buluyor. , Daha iyi sonuçlar elde protokolleri daha güçlü hale getirmek ve implante edilebilir piller için yeni kaynaklar bulma 4,5 son araştırma odağı . Hücre tedavileri etkinliğinin incelenmesi kolay bir iş değildir ve yeni araçlar, tedavi sürecinin 6 katılan mekanizmalarının araştırılması için ihtiyaç vardır . Iskemi / reperfüzyon deneysel bir protokol, ve kök hücre nakli sonrası iskemi / reperfüzyon sırasında hücresel bağlantıları ve hatta hücre içi mekanizmaları gözlem izin ve hücre tedavisinin etkinliğini değerlendirmek amacıyla tasarlanmıştır. H9c2 cardiomyoblast hücreleri, hücre kültürü plakaları 7,8 üzerine yerleştirilir . İskemi glikoz serbest bir ortamda% 0.5 altında oksijen seviyesi ile 150 dakika ile simüle edildi. Sonra, normal medya ve oksijen seviyesi reperfüzyon simüle etmek için tekrar edilmiştir. Oksijen glikoz yoksunluk sonra,hasarlı hücreleri kültürüne ekleyerek elde edilen mezenkimal kök hücreler işaretli insan kemik iliği nakli ile tedavi edildi. Mezenkimal kök hücreleri, minimal invaziv cerrahi ile kolayca erişilebilir, kolayca genişletilebilir ve otolog, çünkü klinik çalışmalarda tercih edilir. Eş-yetiştiriciliği 24 saat sonra, hücreler canlı ve ölü hücrelerden ayırt etmek Calcein ve ethidium-homodimer ile boyandı. Bu kurulum bize konfokal floresan mikroskobu kullanarak hücrelerarası bağlantıları araştırmak ve postiskemik hücreler flow sitometri ile hayatta kalma oranını ölçmek için izin verdi. Mikroskopisi gibi hücre füzyon ve hücrelerarası nanotüpler oluşumu gibi iki hücre popülasyonlarının etkileşimleri gösterdi. Flow sitometri analizi hasarlı hücrelerinin bir grafik üzerinde çizilen ve istatistiksel analiz edilebilir 3 kümeleri ortaya çıkardı. Bu kesimler ayrı ayrı araştırılmalıdır ve sonuçlar simüle etkinliğini bu veriler üzerinde çizilebilirterapötik yaklaşım.

Protokol

1. H9c2 kardiyomyoblast hücrelerinin hazırlanması

H9c2 sıçan kardiyomiyoblastları ATCC'den (Wesel, Almanya) temin edilmiş ve %10 fetal bovine serum, 4 mM L-glutamin, 100 U/ml penisilin ve 100 μg/ml streptomisin içeren yüksek glukozlu (4.5 g/L) DMEM'de genişletilmiştir. H9c2 miyoblast hücre hattı, embriyonik sıçan kalbinden türetilmiştir ve hem iskelet hem de kalp kası için bir in vitro model olarak kullanılır 8,9.

H9c2 hücreleri içeren 12 kuyucuklu plak hazırlayın:

  1. H9c2 hücrelerinin bulunduğu Petri kabındaki kültür ortamını uzaklaştırın.
  2. Hücreleri iki kez 5 ml PBS ile yıkayın ve 2-3 ml %0,05 tripsin/EDTA ile sindirin.
  3. Petri kabını 5 dakika boyunca 37°C'deki inkübatöre yerleştirin.
  4. Tripsini 10 ml DMEM kültür ortamı ile inhibe edin.
  5. Hücreleri 1200 RPM'de 8 dakika boyunca santrifüjleyin.
  6. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri 1 ml DMEM kültür ortamında yeniden süspanse edin ve Trypan Blue boyaması kullanarak hemositometre ile hücre sayımı yapın.
  7. 12 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa, 2 ml DMEM içerisinde 30.000 H9c2 hücresi ekleyin.
  8. Plakayı 24 saat boyunca 37°C CO2 inkübatörüne yerleştirin.

2. Simüle edilmiş iskemi/reperfüzyon

İskemi/reperfüzyon, H9c2 hücre kültürlerine oksijen glukoz yoksunluğu (OGD) uygulanarak in vitro olarak simüle edilmiştir. Bu işlem, OGD sırasında hücrelerin gözlemlenmesine olanak tanıyan PeCon hücre inkübasyon sistemine (Erbach, Almanya) sahip Zeiss konfokal mikroskobun tablasında gerçekleştirilmiştir.

  1. H9c2 hücrelerinin bulunduğu 12 kuyucuklu plakadan besiyerini aspirasyonla uzaklaştırın.
  2. Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.
  3. Her kuyucuğa 3 ml glukozsuz besiyeri ekleyin.
  4. Plakayı hücre inkübasyon sistemine yerleştirin.
  5. İnkübasyon sistemindeki oksijeni dışarı atmak için azot gazını başlatın.
  6. Oksijen seviyesi %0,5'e ulaşana kadar bekleyin ve ardından zamanlayıcıyı başlatın. %0,5 oksijen, yaklaşık 3 mmHg kısmi gerilim anlamına gelir. Hücreleri 150 dakikalık simüle edilmiş iskemiye tabi tutun.
  7. Simüle edilmiş iskemi sonunda, glukozsuz besiyerini hücrelerden uzaklaştırın.
  8. Kuyucuklara 2 ml normal kültür besiyeri pipetleyin.
  9. 12 kuyucuklu plakayı 30 dakika boyunca 37°C CO2 inkübatöründe bekletin; bu "reperfüzyon dönemi"dir.

3. Kurtarma mezenkimal kök hücrelerinin hazırlanması

İnsan kaynaklı kemik iliği T75 flasklara alındı ve %10 fetal calf serum (FCS), 100 U/ml penisilin ve 100 μg/ml streptomisin, 4 mM L-glutamin ve 1 g/l glukoz içeren Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) kültür ortamı ile seyreltildi. Flasklar, %5 CO2 içeren tam nemlendirilmiş bir atmosferde, 37°C'de 3 gün boyunca inkübe edildi. İnkübasyon süresinin ardından BMSC'ler flaskların yüzeyine tutundu ve kemik iliğinin geri kalan bileşenleri PBS ile yıkanarak uzaklaştırıldı. Deneylerde kullanılan BMSC'ler 1 ila 5 pasaj arasındaydı. Hücrelerin kimliği, akış sitometrisi ile soyağa özgü hücre yüzey markerlarının varlığıyla doğrulandı. Hematopoetik soy ağacına özgü yüzey markerları (CD34, CD45) ve mezenkimal yüzey markerları (CD73, CD90, CD105 ve CD166) incelendi.

Simüle edilen iskemi sırasında, transplantasyon için kurtarma mezenkimal kök hücrelerini hazırlayın.

  1. Vybrant DiD floresan boyasını, DMEM kültür ortamında 1:200 oranında seyreltin.
  2. Kurtarma hücrelerindeki ortamı aspire edin ve 300 μl Vybrant DiD içeren DMEM ekleyin.
  3. Petri kabını 37°C CO2 inkübatöründe 30 dakika bekletin.
  4. Mezenkimal kök hücrelerin bulunduğu Petri kabındaki kültür ortamını uzaklaştırın.
  5. Hücreleri 5 ml PBS ile iki kez yıkayın ve 2-3 ml %0,05 tripsin/EDTA ile sindirin.
  6. Petri kabını 37°C inkübatörde 5 dakika bekletin.
  7. Trypsin etkisini 10 ml DMEM kültür ortamı ile inhibe edin.
  8. Hücreleri 1200 RPM'de 8 dakika santrifüjleyin.
  9. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri 1 ml DMEM kültür ortamında yeniden süspanse edin ve Trypan Blue boyaması kullanarak hemositometre ile hücreleri sayın.
  10. Reperfüzyonun sonundaki 30. dakikada, post-iskemik H9c2 kardiyak miyoblastlarının bulunduğu her kuyucuğa 20.000 mezenkimal kök hücre ekleyin.
  11. Hücrelerin ko-kültürünü 24 saat boyunca 37°C CO2 inkübatöründe bekletin.

4. Konfokal mikroskopi ile analiz

Simüle edilmiş iskemi/reperfüzyon hasarının ardından, hücreler 24 saat boyunca normal kültür ortamında inkübe edilir.

  1. 24 saat sonra hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.
  2. Hücreleri 500 μl canlı/ölü boya çözeltisinde (PBS içinde 5 nM calcein ve 400 nM Ethidium-homodimer-2) (5x104 hücre/ml) 30 dakika boyunca boyayın.

Morfoloji ve floresanla seçilen canlı ve ölü hücrelerin konfokal görüntülerle değerlendirmesi ImageJ yazılımı (National Institutes of Health, ABD) ile gerçekleştirilebilir. Ko-kültürler durumunda, MSC'ler Vybrant DiD hücre etiketlemeleri sayesinde H9c2 hücrelerinden ayırt edilebilir. Ölü hücre oranı, her kültür için 4 bağımsız görüş alanında (10x objektif) körleme yöntemiyle değerlendirilebilir10.

42 mm'lik cam lamlar üzerinde kültüre edilen H9c2 kardiyomiyoblastları, konfokal mikroskobun hücre inkübasyon sistemi kullanılarak iskemi/reperfüzyon yaralanması sırasında ve sonrasında time-lapse video mikroskopi ile incelenebilir. Hücre füzyonu ve hücreler arası nanotüplerin oluşumu gibi hücreler arası etkileşimler zaman içinde çalışılabilir.

5. Akış sitometrisi ile analiz

Simüle edilmiş iskemi/reperfüzyon hasarının ardından, hücreler 24 saat boyunca normal kültür ortamında inkübe edilir.

  1. 24 saat sonra kültür ortamını toplayın. 24 saatlik inkübasyon sırasında bazı ölü hücrelerin kültür kabı yüzeyinden ayrılmış olabileceği için kültür ortamının da toplanması çok önemlidir.
  2. Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve %0,05 trypsin-EDTA ile sindirin.
  3. Trypsini DMEM kültür ortamı ile inhibe edin.
  4. Hücreleri ve toplanan kültür ortamını 1200 RPM'de (yaklaşık 150-200g) 8 dakika boyunca santrifüjleyin.
  5. Süpernatantı uzaklaştırın.
  6. Hücreleri 30 dakika boyunca 500 μL canlı/ölü boya çözeltisinde (PBS içinde 5 nM calcein ve 400 nM Ethidium-homodimer-2) süspande edin (5x104 hücre/ml).
  7. Hücreleri akış sitometrisi tüplerine aktarın.
  8. CellQuest Pro yazılımını başlatın.
  9. Akış sitometresini ölçüm için ayarlamak amacıyla canlı ve ölü hücre kontrol örnekleri hazırlayın.
    1. H9c2 hücrelerini, 1. maddede açıklandığı gibi, 12 kuyucuklu plakalara 3x104 yoğunluğunda ekin.
    2. 1. maddede açıklandığı gibi, tek seferlik tripsinizasyon ile canlı hücre kontrollerini hazırlayın.
    3. 10 μM H2O2 ile 1 saat boyunca işlem yaparak ölü hücre kontrollerini hazırlayın.
    4. Tripsinizasyon sonrası, canlı ve ölü hücre kontrollerini 500 μl canlı/ölü boya çözeltisinde (PBS içinde 5 nM calcein-AM ve 400 nM Ethidium-homodimer-2) yeniden süspande edin.
  10. Cihaz ayarları, canlı hücrelerin calcein pozitif ve ethidium homodimer negatif, ölü hücrelerin ise calcein negatif ve ethidium homodimer pozitif olacağı şekilde ayarlanmalıdır.
  11. Bu popülasyonların yüzdesi bir grafikte sütunlar olarak ifade edilebilir ve bu değerler üzerinden istatistiksel analiz gerçekleştirilebilir.
  12. Farklı deneysel grupları ölçün.

6. Temsili sonuçlar:

Sonuçlarımız, eklenen mezenkimal kök hücrelerin post-iskemik kardiyak hücrelerin sağkalımını iyileştirebileceğini göstermiştir. Konfokal mikroskopi görüntüleri, gözlemlenen korumada muhtemelen önemli bir rol oynayan, kısmi membran bağlantısı veya hücreler arası nanotüpler gibi doğrudan hücreden hücreye etkileşimleri ortaya çıkarmıştır10. Bu nanotüpler birkaç hücre çapı boyunca uzanmakta olup çapları 200 ve 500 nm arasındaydı (beyaz oklar).

Floresan mikroskopi görüntüsü; yeşil ve kırmızı belirteçlerle hücre etiketlemesi, ölçek çubuğu 50 µm.
Şekil 1. Hücreler arasında nanotüp oluşumu. Vybrant DiO ile etiketlenmiş kardiyomiyoblastlar ve Vybrant DiD ile etiketlenmiş mezenkimal kök hücreler arasında nanotüp oluşumu (beyaz ok) gözlemlenmiştir.

Akış sitometrisi analizi, hayatta kalan ve nekrotik kardiyomiyoblastlar ile mezenkimal kök hücre popülasyonlarını göstermiştir. İlginç bir şekilde, kalsiyen içeren ancak aynı zamanda ölü hücrelerin göstergesi olan etidyum homodimeri de içeren üçüncü bir 'hasarlı' kardiyomiyoblast hücre popülasyonu da gözlemledik (Şekil 2).

Akış sitometrisi nokta grafiği, hücre canlılığı analizi: canlı, hasarlı, ölü ve döküntü hücre popülasyonları.
Şekil 2. Simüle edilmiş iskemi sonrası farklı hücre popülasyonlarının temsili nokta grafiği.

Çeşitli deneylerin değerlendirmesi, mezankimal kök hücre eklemesinin, iskemi sonrası tek başına kültüre edilen kardiyomiyoblastlara kıyasla, post-iskemik H9c2 kardiyomiyoblastlarında canlı hücre yüzdesini anlamlı derecede artırdığını göstermiştir (Şekil 3).

Kontrol, I-R modeli ve I-R+BMSC koşullarındaki canlı hücre yüzdesini gösteren sütun grafiği, analiz.
Şekil 3. Kök hücre tedavisinin post-iskemik kardiyomiyoblastlar üzerindeki etkisi. Canlı hücre yüzdesi, kontrole kıyasla simüle edilmiş iskemi sonrası önemli ölçüde azalmış (kontrol vs. I-R modeli: 90.36±2.60 vs. 10.52±0.48, *** p>0.001), mezenkimal kök hücrelerin eklenmesiyle birlikte ise artış göstermiştir (I-R modeli vs. I-R + BMSC: 10.52±0.48 vs. 25.21±2.13, *** p>0.001). Veriler ortalama±SEM olarak sunulmuştur. Verilerin istatistiksel analizi, Tukey çoklu karşılaştırma post hoc testi ile tek yönlü varyans analizi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Göstermiştir protokol in vitro bir yaklaşım, böyle bir modelin tüm avantaj ve dezavantajları ile miyokard infarktüsü kök hücre tedavisi, çok daha karmaşık bir sorun. Açıkçası miyokard infarktüsü sırasında ve sonrasında meydana gelen karmaşık olayları (örneğin immünolojik) yansıtmamaktadır ancak eklendi hücreleri postiskemik hücreleri üzerinde doğrudan etkileri odaklanabilirsiniz. H9c2 cardiomyoblasts simüle iskemi etkileri çok kullanılan hücre geçiş sayısı ve O 2 konsantrasyonu, OGD zaman bağlıdır. Bir doğru,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu çalışma OTKA (Macarca Bilimsel Araştırma Fonu) D45933, T049621, TET (Macarca Bilim ve Teknoloji Vakfı) A4/04, Arg-17/2006 ve SIN, Bolyai, Öveges Burslar ve TÁMOP tarafından desteklenen 4.2.2-08 / 1 / KMR-2008-0004 ve 4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83.803. William Gesztes üzerinden ses sağlamak için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifi Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
Calcein-AM Moleküler Probları L3224, C3099 http://www.invitrogen.com
ethidium homodimer-2 Moleküler Probları L3224, E3599 http://www.invitrogen.com
Vybrant DID Moleküler Probları V22887 http://www.invitrogen.com

Tablo 1. Reaktifler.

Ekipman Adı Şirket Yorumlar (isteğe bağlı)
Pecon hücre kuluçka sistemi Zeiss mikroskoplar Pecon GmbH www.pecon.biz/

Tablo 2. Ekipman.

Kaynaklar

  1. Dimmeler, S., Burchfield, J., Zeiher, A. M. Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (2008).
  2. Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review. Journal of Neuroscience Research. 87, 2183-21 (2009).
  3. Lee, K., Chan, C. K., Patil, N., Goodman, S. B. Cell therapy for bone regeneration-Bench to bedside. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 89, 252-25 (2009).
  4. Gaipa, G. GMP-based CD133+ cells isolation maintains progenitor angiogenic properties and enhances standardization in cardiovascular cell therapy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1619-1619 (2010).
  5. Trounson, A. New perspectives in human stem cell therapeutic research. BMC medicine. 7, 29-29 (2009).
  6. Mazhari, R., Hare, J. M. Mechanisms of action of mesenchymal stem cells in cardiac repair: potential influences on the cardiac stem cell niche. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, Suppl 1. S21-S21 (2007).
  7. Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental Cell Research. 98, 367-367 (1976).
  8. Sardao, V. A. Vital imaging of H9c2 myoblasts exposed to tert-butylhydroperoxide--characterization of morphological features of cell death. BMC Cell Biol. 8, 11-11 (2007).
  9. Hescheler, J. Morphological, biochemical, and electrophysiological characterization of a clonal cell (H9c2) line from rat heart. Circulation research. 69, 1476-1476 (1991).
  10. Cselenyak, A. Mesenchymal stem cells rescue cardiomyoblasts from cell death in an in vitro ischemia model via direct cell-to-cell connections. BMC Cell Biol. 11, 29-29 (2010).
  11. Sauvant, C. Implementation of an in vitro model system for investigation of reperfusion damage after renal ischemia. Cell Physiol Biochem. 24, 567-567 (2009).
  12. Namas, R. A. Hypoxia-Induced Overexpression of BNIP3 is Not Dependent on Hypoxia-Inducible Factor 1alpha in Mouse Hepatocytes. Shock. 36, 196-196 (2011).
  13. Cao, L. Hypoxia/Reoxygenation Up-Regulated the Expression of Death Receptor 5 and Enhanced Apoptosis in Human Hepatocyte Line. Transplantation Proceedings. 38, 2207-2207 (2006).
  14. Meloni, B. P., Meade, A. J., Kitikomolsuk, D., Knuckey, N. W. Characterisation of neuronal cell death in acute and delayed in vitro ischemia (oxygen-glucose deprivation) models. Journal of Neuroscience Methods. 195, 67-67 (2011).
  15. Mimeault, M., Hauke, R., Batra, S. K. Stem cells: a revolution in therapeutics--recent advances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative medicine and cancer therapies. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 82, 252-252 (2007).
  16. Angoulvant, D. Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury. J Heart Lung Transplant. 30, 95-95 (2010).
  17. Lim, Y. J., Zheng, S., Zuo, Z. Morphine Preconditions Purkinje Cells against Cell Death under In Vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Conditions. Anesthesiology. 100, 562-562 (2004).
  18. Guo, J. Estrogen-receptor-mediated protection of cerebral endothelial cell viability and mitochondrial function after ischemic insult in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 30, 545-545 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mezenkimal K k H crelerKonfokal MikroskopiAk SitometrisiOksijen Glikoz Yoksunlu uH9c2 H creleriH cre K lt r PlakalarCanl l BoyamaH creler Aras Ba lant lar

İlgili makaleler