Biz civciv E4 statoacoustic ganglion ve E6 omurilik eksplantlar incelemek ve kültürüne nasıl gösterilmektedir. Eksplantlarındaki 24 saat için 3D kollajen jel serum serbest koşullar altında kültüre. Neurite yanıt büyüme faktörü desteği orta ve protein kaplı boncuklar ile test edilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Diseksiyon ve Chick Statoacoustic Ganglion ve Kollajen Jeller Omurilik eksplantlar Kültür Neurite akıbet Tahliller
Bu makalede
Özet
Özet
Tavuk iç kulak duyu organları statoacoustic ganglion (SAG) nöronların periferik süreçleri tarafından innerve edilir. Duyu organı innervasyon akson rehberlik yörünge boyunca büyüyen aksonlar ve / veya duyu organı hedeflerine içinde bulunan ipuçları 1 ve hayatta kalma faktörleri 2 bir arada bağlıdır. Örneğin, klasik bir akson rehberlik sinyal yolağı, semaphorin-neuropilin ile fonksiyonel otik aksonlar 3 parazit misrouting oluşturulur. Ayrıca, çeşitli büyüme faktörleri nörotrofin-3 (NT-3) ve beyin türevli Nörotrofik Faktör (BDNF) de dahil olmak üzere, iç kulak duyu hedefler, ifade SAG aksonlar 4 misrouting yeniden lider, transgenik hayvanlar manipüle edilmiştir. Bu aynı molekülleri in vitro 5,6 hayatta kalma ve civciv SAG nöronların neurite akıbet teşvik.
Burada, tarif ve in vitro yöntem şu anda u göstermekbilinen Wnts gibi morphogens yanı sıra SAG neurite akıbet ve nöron hayatta kalma teşvik için önemli olan büyüme faktörleri de dahil olmak üzere çözünür proteinler, civciv SAG neurites yanıt test için şarkı. Bu model sistemi kullanarak, salgılanan ligandlar SAG nöron hayatta kalma ve neurite akıbet uygulamayın ki etkileri hakkında sonuçlara varmak için umuyoruz.
SAG eksplantlar, embriyonik gün 4 (E4) disseke ve 24 saat boyunca serum serbest koşullar altında, üç boyutlu kollajen jel kültür. İlk olarak, neurite yanıt verme, protein takviye orta kültür eksplantlar tarafından test edilir. Daha sonra, salgılanan ligandlar noktası kaynakları neurite akıbet yönlü etkilere sahip olup olmadığını sormak için, eksplantlar protein kaplı boncuklar ile co-kültürlü ve yerel teşvik etmek veya akıbet inhibe boncuk yeteneği test. Ayrıca diseksiyon gösteri (protokol 7 değiştirilmiş) ve E6, spinal kord eksplantlar kültürü içerir. Bizrutin proteinleri ve protein batırılmış boncuklar biyoaktivite onaylamak için omurilik eksplantlar kullanımı ve SAG eksplantlar aynı kültür koşulları altında, civciv dokusu ile türlerin çapraz reaktivite doğrulamak için. In vitro tayinlerde Bunlar hızlı bir şekilde özellikle in vivo çalışmalar gerçekleştirmeden önce, trofik (hayatta kalma) veya SAG nöronlar tropik (yönlü) etkilerini gösterirler molekülleri için tarama için uygundur. Dahası, bu yöntem yüksek nöron hayatta kalma 8, serum serbest şartlar altında bireysel moleküllerin test izin verir.
Protokol
Tarifler
Chick Ringers
| 7.2 g | NaCl |
| 0.23 g | CaCl 2 + 2H 2 O |
| 0.37 g | KCl |
| 0,115 g | Na 2 HPO 4 |
| 900 ml | Su (Doku kültürü notu) |
Not: pH 7.4 'e ayarlayın. 1000 ml su ile son hacim kazandırın.
10X PBS
| 40 g | NaCl |
| 1 g | KCl |
| 7 gr | Na 2 HPO 4 |
| 1.2 g | KH 2 PO 4 |
| 450 ml | DEPC su |
Not: pH 7.4 'e ayarlayın. Son getirin500 ml su ile hacim. Çalışma konsantrasyonu (1X), 18 M cm iletkenlik suyu üretmek için bir Millipore UV ışınlama sistemi ile elde edilen gibi 9 parça, doku kültürü sınıf su ile 1 parçası 10X stok seyreltilmesi ile yapılır.
Eksplant tutarak orta SAG
- DMEM/F12 L-glutamin, 10 mM HEPES
- % 10 İnsülin, aktarma, Selenyum (DA 1)
- % 1 pen-strep
Eksplant kültür ortamı
- Eksplant tutarak orta SAG
- 10 ng / ml nörotrofin-3 (NT-3)
- 10 ng / ml siliyer nörotrofik faktör (CNTF)
Omurilik diseksiyonu ve holding orta
- L-15
- % 10 fetal buzağı serumu
- % 1 pen-strep
37-38 inkübe yumurta ° C % 70 etanol araçları ve Sylgard diseksiyon çanak diseksiyon sterilize edin. Diseksiyon yemekleri ve araçlar da UV gecede sterilize edilmelidir.
1. Boncuk hazırlık
- 1 ml steril PBS, mix, ve tüp altına yerleşmek için boncuk beklemek bir mikrotüp yerleştirin boncuklar.
- Boncuk boncuk yerleşti ve PBS içinde tekrar süspansiyon sonra süpernatantı kaldırarak birkaç kez yıkayın.
- Boncuk saflaştırılmış protein (PBS içinde seyreltilmiş) veya PBS tek başına (Kontrol) oda sıcaklığında 1 saat inkübe.
- Kollajen yerleştirilir kadar 1ml PBS ile 24 plaka PBS ve mağaza boncuk durulayın.
2. Statoacoustic ganglion diseksiyonu
- E4, yumurta, embriyo kaldırmak ve embriyonik membranlar kaldırmak için civciv Ringer solüsyonu ile bir tabak koyun.
- Soğuk HBSS ve yukarı bakacak şekilde otik vezikül yan pozisyonda embriyo ile dolu bir Sylgard © çizgili petri embriyo yerleştirin. Diseksiyon pimleri kullanarak çanak embriyo Pin.
- Iki diseksiyon pimleri kullanarak, deri yoluyla yatay bir kesi yapmak hemen ventralkanal torbalar, yaklaşık koklear kanal birleştiği yerde. Dikey bir kesim anterior ve posterior SAG olun. Üç kesimler tarafından sınırlanmıştır cilt kapağı kaldırın ve çıkarmak için forseps veya bir diseksiyon iğnesi kullanın.
Not: SAG aydınlık temel aydınlatma ile kolayca görülebilir sırt çantası ve ventromedially projeleri ve faringeal kemerler gizlenmiş ventral koklear kanal arasında yarı yolda, yaklaşık otocyst anteroventral kenarında yer almaktadır. Koklear kanal uzar dorsoventral boyut böylece giderek Hamburger-Hamilton aşamaları 23-25 Eylül arasında E4 artacaktır.
- SAG ayrı bir posterior yönde otocyst çekin. SAG diseksiyonu iğneler ile çevresindeki doku çekilin ve SAG # 55 forseps kullanarak embriyo dikkatlice çıkarın. Mezenkimal doku ve sinir demetleri SAG çıkıntılı büyük boyutta çıkarın.
- Geniş ağızlı pipetlemeyin uç kullanarak, bir eksplantOrta tutarak 0.5 ml SAG eksplant ile 24 plaka. 4 saate kadar buz üzerinde veya oda sıcaklığında eksplantlar tutun.
3. Omurilik diseksiyonu
- E6 embriyo yumurta çıkarın ve civciv Ringer çözeltisi içeren bir çanak koyun. Baş ve embriyonik zarlar çıkarın.
- Bir Sylgard vücudun © soğuk omurilik diseksiyon orta içeren diseksiyon çanak yerleştirin. Pozisyon ve deneyi karşı karşıya embriyo "ventral aşağı" ve kaudal pin. Her uzuv ile ön sonuna kadar diseksiyon pimleri yerleştirin.
- Forseps ve / veya diseksiyon pimleri, omurilik dorsal yüzeyinde görünür oluncaya kadar dikkatle, ventral yönde hareket, deri ve doku çıkarmak.
- Tüm uzunluğu boyunca, spinal kord, anterior yönüne posterior diseksiyon bir iğne ile omurilik dorsal orta hat kesin. Bu omurilik ayrı sol ve sağ tarafında bir "açık kitap" oluşturur.
- , Yanal, çevre dokuya çıkarın omurilik izole etmek ve dorsal kök gangliyon (DRG) maruz bırakmayın. DRG ve meninksler omurilik ve DRG arasında bir diseksiyon iğnesi ya da forseps ovuşturarak çıkarın.
- Forseps ile omuriliğin en kaudal ucunu tutarak ve deneyci kadar uzak kaldırma vücut omurilik çıkarın. DRG ve meninksler kalan çıkarın.
- Forseps (ya da çanak pin) ile omuriliğin bir ucundan tutun ve omurilik ikiye bölmek için, ventral orta hat boyunca kesmek için Vannas makas kullanın.
- Doku hareketsiz ve doku uzunluğu boyunca küçük eksplantlar (100-500 um uzunluğunda) kesmek için Vannas makas kullanmak için forseps ile eksplant bir ucundan tutun. Taban plakası ile bir eksplant kenarı boyunca net bir doku kalınlaşması olarak kabul edilebilir.
- 0.5 ml soğuk diseksiyon orta ile 24 plaka eksplantlar aktarmak için geniş bir ağız pipetlemeyin ucu kullanın. , F doku canlılığını korumak için buz üzerinde eksplantlar tutunveya 4 saate kadar.
4. Neurite yanıt test etmek için saflaştırılmış proteinlerin kültür Eksplant
- Üreticinin talimatlarına göre, buz, 15 ml konik bir tüp içinde bir 1.5 mg / ml kollajen çözüm hazırlayın.
- Kollajen çözüm 7-7.4 kullanarak pH indikatör kağıdı pH olduğundan emin olun. 1 ul hacimleri NaOH ekleyerek pH ayarlayın.
- Geniş bir ağız pipetlemeyin ucu ve aspirat aşırı sıvı kullanarak 24 plaka eksplantlar aktarın. Çoklu eksplantlar iyi bir kültür olabilir, ama birbirinden ayrı en az 500 mikron konulmalıdır.
- Iyi eksplant içeren 0.5 ml kollajen ekleyin. Kuyunun alt yüzeyinde eksplant yerleştirin. Kollajen, oda sıcaklığında polimerize başlayacak, çünkü her kültürün sonraki iyi geçmeden önce tamamen emin olun.
- Kollajen polimerize ° C slayt 30-45 dakika süreyle sıcak bir 37 kültür plakası yerleştirin. Kollajen polymebir jel benzer rized.
- Saflaştırılmış proteinlerin (PBS içinde seyreltilmiş) veya PBS (kontrol) ile desteklenmiş 0.5 ml sıcak eksplant kültür ortamı ve 37 inkübe ° C,% 5 CO 2. Neurite akıbet Üzerindeki Etkileri 24 saat görünür olmalıdır.
NOT: Biz 42 saat kültür SAG eksplantlar aynı protokolü kullandık.
5. Yönlü neurite akıbet test etmek için protein kaplı boncuklar ile birlikte kültür Eksplant
- Eksplant kültür 4,1-4,4 adımları ile başlayın.
- PBS kollajen çözüm ve eksplant içeren bir pipetlemeyin kullanarak, transferi 1-5 boncuk.
- Eksplant kenarına boncuk 50-500 mikron konumlandırmak için forseps kullanın.
- Kollajen polimerize ° C slayt 30-45 dakika süreyle sıcak bir 37 plaka koyun. Doku veya boncuk kollajen polimerize olarak yerinden olabilir. Ilk 5 dakika boyunca kültürler ve yeniden pozisyon doku ve boncuk kontrol edin.
- 0,5 ml Her iyi medya SAG ve 24 saat inkübe edin.
6. Immünhistokimya neurite akıbet Görselleştirme
- PBS içinde kültürleri çalkalayın ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle PBS içinde% 4 paraformaldehid düzeltmek.
- Jellerin kenarında bir teflon mikro spatula yuvarlak ucu ile izleme kuyuların duvarlarında jeller bırakın. Kuyularında jeller immunostain gerçekleştirin. PBS içinde birkaç kez durulayın.
- 4 geceleme 0.5 ml engelleme solüsyonu (% 10 buzağı serumu, PBS içinde% 0,1 Triton X-100,% 0,1 sodyum azid) ° C de inkübe
- 4 gecede 0.5 ml primer antikor (anti-β-tubulin antikor 1:500 sulandırılmış çözümü engelleme) inkübe ° C
- PBS içinde birkaç kez durulayın. 4 gecede 0.5 ml sekonder antikoru (Alexa Florlu 488 keçi anti-fare IgG 2b antikor 1:500 sulandırılmış) inkübe ° C Bu adım ileri, ışık duyarlılığı nedeniyle, folyo ile karanlık veya sarın tabak, tutmaksekonder antikorlar.
- 4 ° C PBS içinde bir haftaya kadar, PBS ve mağaza birkaç kez durulayın.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1. Saflaştırılmış NT-3 ve NT-3-kaplı boncuklar E4 civciv SAG eksplantlar neurite destekleyici etkileri Temsilcisi sonuçlar. SAG nöron hücre gövdeleri ve neurites β-tubulin ile boyanmış ve konfokal mikroskobu 10x amacı ile görüntülenmiş. In vitro olarak 24 saat sonra, SAG eksplantlar denetimleri (1A) ile karşılaştırıldığında, 100 ng / ml saflaştırılmış insan NT-3 hücre kültür vasatı (1B) varlığında büyük neurite akıbet görüntülenir. SAG nöronlar, NT-3 bir nokta kaynak yerel neurite akıbet teşvik olduğunu göstermek için in100 ng / ml, NT-3 batırılmış boncuklar ile birlikte kültüre edildi. Eksplantlarındaki uzun görüntülenir ve yan yoğun neurite akıbetboncuk karşı tarafında (1D) ve PBS (1C) batırılmış boncuklar ile kültürler kontrol ile karşılaştırıldığında karşı karşıya eksplant. Ölçek çubuğu = 200 mm.
Şekil 2. E6 civciv omurilik saflaştırılmış Wnt5a ve Wnt5a kaplı boncuklar neurite destekleyici etkileri Temsilcisi sonuçlar. Omurilik eksplantlar β-tubulin ile boyanmış ve bir konfokal mikroskobu ile görüntülenmiş. 24 saat saflaştırılmış fare Wnt5a (400ng/ml), civciv, spinal kord eksplantlar neurite akıbet varlığı büyüme artış sonra (2B) (2A) Wnt5a olmadan kültür kontrollere kıyasla. 500 ng / ml Wnt5a batırılmış boncuklar, aynı zamanda kültürleri (2C) kontrolü ile karşılaştırıldığında neurite akıbet (2D) terfi 300-500 mikron omurilik eksplantlar kenarına yerleştirilir. Benzer ko-kültür sonuçları Wnt5a-ifade hücreleri 8 ile daha önce yayımlanmıştır . Ölçek çubuğu = 200mikron.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz bir yöntem serum koşullar altında, civciv, kültür E4 SAG ve E6 omurilik eksplantlar teşrih ve sunar. Bu prosedür şu anda SAG nöron hayatta kalma ve neurite akıbet çeşitli salgılanan ligandlar etkilerinin incelendiği laboratuvarda kullanılır. Bu protokolün Roman yönlerini, kültür eksplantlar ve SAG neurite akıbet etkilerini incelemek için büyüme faktörleri batırılmış boncuk kullanımı için serum ücretsiz sistem kullanımını içerir. Civciv omurilik 10 bizimkine benzer bir boncuk yöntemi tarif edilmiştir. Gele...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Hibe RO1DC002756 Enstitüleri ve Purdue Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi. Doris Wu ve Wiese Chang Biz deney ve figürleri ile yardım için Rodney McPhail tavsiye için teşekkür ederim.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif | Şirket | Katalog numarası | Yorum |
| Ekipman | |||
| Diseksiyon mikroskobu | Biz aydınlık baz aydınlatma ile Leica M80 stereomikroskopta | ||
| Sıcak kaydırın. | CS & E. | Kollajen polimerizasyon | |
| Piliç kuluçka | |||
| 37 ° C /% 5 CO 2 nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatör | |||
| Diseksiyon Malzemeleri | |||
| Sylgard &kopyası; kaplı petri | |||
| 24-kuyu hücre kültürü plaka | Corning | 3526 | |
| # 5 Dumont forseps | Güzel Bilim Araçları | 11252-30 | |
| # 55 Dumont forseps | Güzel Bilim Araçları | 11295-51 | |
| Paslanmaz çelik diseksiyon pimleri | Güzel Bilim Araçları | 26002-10 | Embriyo çivileme, ince diseksiyon |
| Moria delikli kaşık | Güzel Bilim Araçları | 10370-17 | Embriyo hasat / transfer |
| 200 ul geniş ağız pipetlemeyin ipuçları | Nokta Scientific Inc | 118-96R | Eksplant transferi |
| E4 ve E6 tavuk yumurtası | & Nbsp; | ||
| Chick Ringer solüsyonu | Embriyo hasat | ||
| HBSS | Sigma | H8264 | Diseksiyonu SAG |
| L15 orta | Sigma | L5520 | Omurilik diseksiyon orta |
| Fetal buzağı serumu | Atlanta Biyolojik | S11150 | Omurilik diseksiyon orta |
| Vannas Makas | Dünya Hassas Aletler | 501778 | Omurilik diseksiyonu |
| Kollajen hazırlık | |||
| Rat-tail Kollajen Tip I | BD Biosciences | 354249 | Eksplant kültür |
| 10X PBS (Steril) | Neu içinkollajen tralize | ||
| 1N NaOH (Steril) | Kollajen nötralize | ||
| Damıtılmış su (Steril) | Kollajen nötralize | ||
| pH indikatör kağıtları (6,0-8,1) | Whatman | 2629-990 | Kollajen pH kontrol etmek için |
| 15 ml konik tüpler | Nokta Scientific Inc | 818-PG | |
| 500 ul geniş ağız pipetlemeyin ipuçları | Nokta Scientific Inc | 119-R100 | Pipetlemeyin kollajen |
| Eksplant kültür | |||
| DMEM/F12 orta | Sigma | D8437 | Eksplant kültür ortamı |
| ITS 1 | Sigma | I2521 | Orta ek |
| Penisilin-Streptomisin | Invitrogen | 15140-122 | Orta ek |
| CNTF (sıçan) | Sigma | C3835 | Orta ek |
| NT-3 (insan) | Sigma | N1905 | Orta ek |
| Saflaştırılmış fare Wnt5a | R & D Systems | 645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue jel boncuklar | Bio-Rad | 153-7302 | |
| İmmünohistokimya | |||
| Paraformaldehit | Sigma | P6148 | Tespit |
| PBS | Duruluk | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Engelleme çözüm |
| Sodyumazid | Sigma | S8032 | Engelleme çözüm |
| Buzağı serumu | Invitrogen | 16170-078 | Engelleme çözüm |
| Fare monoklonal IgG2b anti-β tubulin 1 + II antikor | Sigma | T8535 | Etiketler hücre gövdeleri ve neurites |
| Alexa Florlu 488 keçi anti-fare IgG2 b antikor | Invitrogen | A21141 | Β tubulin antikor Algılar |
| Teflon mikro spatula | VWR | 57949-033 | Kuyudan Yayın kollajen jeller |
Kaynaklar
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia. Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).
- Gu, C. Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development. Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).
- Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea. J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).
- Avila, M. A. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons. Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).
- Bianchi, L. M., Cohan, C. S. Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor. Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).
- Juurlink, B. ernhardH. J. Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture. Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).
- Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons. Hear. Res. , (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).
- Bourikas, D. Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).
- Augsburger, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).
- Lyuksyutova, A. I. Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling. Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
