Yöntem makalesi

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

DOI:

10.3791/3609

⸱

14 Ocak 2012

 ,  ,  , 
1Department of poverty related diseases, Barcelona Centre for International Health Research, 2Confocal Microscopy Unit, University of Barcelona- Scientific and Technological Centers, 3Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GFP transgenik sıtma parazitleri ve bu organ içinde parazit hareketlilik ve kan akımının ölçülmesi ile dalak intravital mikroskobi gerçekleştirmek için yöntem gösteriyor.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parazit-konak etkileşimleri 1,2 bilgisine deneysel kemirgen sıtma modelleri intravital mikroskopi gelişiyle büyük ilerlemelere yol açmıştır. Böylece, deri lenf düğümleri 3, 4 cilt parazit tam gelişimi ve hepatosit-türevli merosome göçü sağlamak için bir oluşum içine öncesi eritrosit aşamaları sırasında, sıtma parazitleri in vivo görüntüleme aktif giriş parazitlerin ortaya . 5 kan akışı içine merozoites bırakın. Ayrıca, bireysel eritrositler parazitlerin gelişme son zamanlarda 4D görüntüleme ile belgelenir ve sıtma 6 protein ihracat meydan olmuştur . Böylece, intravital görüntüleme Plasmodium gelişiminde önemli olaylar bizim kökten değişmiştir. Ne yazık ki, dalak, önemli bir lenfoid organ aracılığıyla sıtma parazitleri dinamik geçiş çalışmaları zarif bulaşmış kırmızı b temizlemek için adaptelood hücreleri teknik kısıtlamaları nedeniyle eksiktir.

Balb / c farelerde sıtma Plasmodium yoelii fare modeli kullanılarak, dalak intravital görüntüleme uygulanması ve sırasında kırmızı hamuru fibroblastik kökenli bariyer hücreleri rapor diferansiyel şekillenmesi ve bağlılığı, parazitlenene kırmızı kan hücreleri (pRBCs ) P.yoelii 17XL ölümcül bir parazit hat 7 ile enfeksiyonlara karşı öldürücü olmayan parazit hat P.yoelii 17X ile enfeksiyon gibi. Bu sonuçlara ulaşmak için, ImageJ özgür yazılım kullanarak belirli bir metodoloji karakterizasyonu tek pRBCs hızlı üç boyutlu hareketi sağlamak için geliştirilmiştir. Bu protokol ile elde edilen sonuçlar, dalak parazitlerin hızı, yönlülük ve ikamet süresi belirlenmesinde izin, tüm parametreler in vivo olarak bağlılık adresleme . Buna ek olarak, kan akışını intravital mikroskopi kullanılarak kantifikasyon ve farklı kullanımı için metodoloji raporferent, karmaşık dalak mikrosirkulasyonu yapısını anlamak için renklendirme ajanları.

Etik bir bildirimde

Tüm hayvan çalışmaları Barcelona CEEA-UB (: 5429 Protokolü DMAH) Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanmış kurallar ve protokoller uyarınca, Barselona Üniversitesi hayvan tesislerinde yapıldı. Charles River Laboratuvarları yaş 6-8 hafta Erkek Balb / c farelerde elde edilmiştir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, 7 bildirilen araştırma kullanılmıştır .

1. Yeşil floresan proteini (GFP) transgenik parazitler Hayvan enfeksiyon

  1. 17XL ve 17X P. yoelii-GFP transgenik hatları, aynı vektörler kullanarak hedeflemesi stratejisine ve protokoller P. için başka yerlerde açıklandığı üretildi berghei 8. Onlar her yerde organizatörü P. altında GFP 9 mutant varyant 3 ifade tüm eritrosit içi gelişim döngüsü sırasında sitoplazmada parazit GFP kurucu ifade yönlendirir berghei uzaması faktör 1 (Pbeef1a).
  2. P. parazitlenene, kırmızı kan hücreleri....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu kemirgen sıtma modeli dalak intravital mikroskopi uygulanması olasılığı şu ana kadar teknik değerlendirmeler için bir "kara kutu" nedeniyle kabul edilmiştir bu organ sayesinde dinamik geçiş parazitleri araştıran açtı. Burada, büyük bir çaba, tek ve nüfus düzeyleri farklı parazit hatları karşılaştırmalı analizi sağlayan kantitatif bir yöntem uyarlamak için konulmuştur. Hızlı ve yavaş önce sıtma 3,5 görüntülenmiştir diğer doku ve hücrelerinin aksine, görüntüleme yoluyla pRBCs dalak geçit organın üç.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. Bosch (Konfokal Birimi, CCIT-UB, IDIBAPS), GFP transgenik parazitler bağış J. Burns, S. Graewe ve V. Heussler sıtma parazitleri intravital mikroskopi başlangıç ​​eğitimi ve sürekli giriş için özellikle teşekkür ediyoruz görüntü analizi ve teknik yardım için ölçümlerini ve P. Astola yardım. Biz R. Tous I. Caralt ve video üretimi için teşekkür ederiz. MF Katalonya Genellik bir yüksek lisans bursu bir alıcı. HAP bir ICREA araştırma profesörü. HAP laboratuvar, hibe anlaşması N çerçevesinde Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) ° 242.095, Özel Vakfı Cellex (Katalonya, İspanya) ve İspanyol Bilim ve Yenilik Bakanlığı (tarafından finanse edilmektedir S....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifi Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
Leica TCS-SP5 konfokal mikroskop Leica Microsystems, Heidelberg, Almanya TCS-SP5 Seri no. 5100000419
Ketamin (Ketolar 50 mg / ml) Pfizer 631028
Midazolam 15 mg / 3 ml Normon 838193
Texas Red konjuge 70.000 MW Dextran'ın Moleküler Probları D1830
Floresein izotiyosiyanat, izomeri (FITC) Sigma F7250
Hoechst 33.342 Sigma H1399
Giemsa leke Sigma GS1 Çalışma çözüm distile su% 10
Super Glue-3 Loctite Loctite 9975-0880

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
  2. Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dalak G r nt lemeKan Ak NicelemesiPlasmodium yoeliiGFP Transgenik ParazitlerKonfokal MikroskopiImageJ AnaliziK rm z Pulga DinamikleriDamar Kan lasyonu

İlgili makaleler