$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Yalıtımlı Yağ-Türetilmiş Kök Hücre (ASC)
Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.
- Sıçan perirenal ve epididimal adipoz yalıtmak ve daha önce 6 açıklandığı gibi% 1 fetal sığır serumu (FBS) içeren steril Hank tamponlu tuz solüsyonu (HBSS) ile yıkayın.
- Doku kıyma ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 500 g'de 50 mL tüpü ve santrifüj içine% 1 FBS içeren HBSS 25 mL içine 1-2 g transfer.
- Serbest yüzen adipoz doku tabakası ve 125 mL erlen transfer toplayın ve 37 az 45 HBSS kollajenaz tip II (200 U / ml) 25 ml ile tedavi ° orbital çalkalayıcı (125 rpm) C.
- Dikkatle sıvı kısmı (petrol ve yağ tabakası altında) kaldırmak ve 100 mikron ve 70 mikron naylon örgü filtre üzerinden sırayla filtre. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g'de santrifüje süzüntü, supernatan aspiret ve 25 ml HBSS ile iki kez pelet yıkayın.
- MesenPRO RS Büyüme katkısı, (100 U / penisilin G, 100 ug / mL streptomisin sülfat, ve 0.25 mg / mL Amphotericin B'nin mL) antibiyotik-antimikotik ile desteklenmiş büyüme medyumu (MesenPRO RS Bazal Medium) 50 mL hücre pelletini ve 2 T75 şişeler (25 mL / şişeye) içine 2 mM L-glutamin ve pipet hücreleri.
- Kültür 37 ° C (Artan Tüm deneyler için kullanılan Geçiş 2-4) de bir% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş ASC.
2. Chitosan Mikroküreler (CSM) hazırlanması
Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.
- CSM önceki protokolü kullanılarak bir iyonik 6 Koaservasyon tekniği ile birlikte, bir su-içinde-yağ emülsiyonlaştırıcı işlemle hazırlanır. Soya oluşan bir yağ fazı karışımı, 100 mL kitosan, sulu bir solüsyonu (0.5 M asetik asit içinde% 3 ağırlık / hacim kitosan 6 mL), emülsifiyeYağ, n-oktanol (1:2 v / v) ve% 5-sorbitan mono-oleat (p 80) emülsiyonlaştırıcı, karşıt yönlerde, üstten (1700 rpm) ve eş zamanlı olarak manyetik olarak karıştırıldı (1000 rpm) kullanılarak. Erken çapraz bağlama meydana gelmeden önce üzerinde oluşan miseller çözüm kalır ve dibe olamaz karıştırma temin eder bu ikili yöntemi. Dahası, içinde manyetik karıştırıcı yardımcıları misel oluşumu ve rigidization sırasında kitosan de-toplamak.
- Karışım sürekli stabil bir su-içinde-yağ emülsiyonu elde edilene kadar yaklaşık 1 saat boyunca karıştırıldı. İyonik çapraz bağlama 4 saat (24 mL toplam) n-oktanol, her 15 dakika içinde% 1 w / v potasyum hidroksit ile 1.5 mL eklenmesi ile başlatılır.
- Çapraz bağlama Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, karışıma yavaş yavaş içeren CSM yağ fazı boşaltacaktır ve hemen aseton 100 mL küreler ekleyin. Yağ fazı, tamamen çıkarılana kadar aseton ile yıkanır küreler.
- Bir vakum desikatörde ve anal olarak kurtarıldı küreler kurulayındaha fazla işlem olmadan yze. Ortalama partikül boyutu CSM, miligram başına yüzey alanı ve birim hacmi kübik parçacık boyutu analiz cihazı ile tespit edildi.
- Sonraki deneyler için, kalıntı tuzları kaldırmak ve mutlak alkol ile sterilize etmek için steril su ile CSM üç kez yıkayın.
3. CSM Serbest Amino Grup Sayısını Belirleme
Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.
- Bubins ve Ofner 7 trinitro benzensülfonik (TNBS) asit yöntemi kullanılarak iyonik çapraz sonra CSM mevcut serbest amino gruplarının sayısını belirleyin. 40 ° C'de 4 saat süreyle 50 mL cam tüp içinde% 0.5 TNBS solüsyonu 1 mL mikrosferler 5 mg inkübe ve 2 saat boyunca 60 ° C'de 6N HCI 3 mL ilavesi ile hidroliz.
- Oda sıcaklığına kadar soğumaya örnekleri, ve deiyonize su ile 5 mL etil 10 ml ilave edilerek serbest TNBS özüeter.
- ° C bir su banyosunda 15 dakika oda sıcaklığına kadar soğutulur ve kalan eter, buharlaşma ve 15 ml su ile dilüe etmek için 40 sulu faz bir 5 ml bir örnek ısıtılır.
- Boş ve kitosan amino gruplarının sayısı tespit etmek CSM hazırlanması için kullanılan şekliyle kitosan olmadan TNBS çözeltisi kullanılarak bir spektrofotometre ile 345 nm'de absorbans ölçün. Kitosan göre CSM serbest amino grubu ile kestirilebilir.
4. CSM içinde yükleniyor ASC
Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.
- Gece steril HBSS bölümünde 2,5 sterilize CSM 5 mg dengeye ve 8 mikron gözenek büyüklüğüne membran kültür plakası eki (24-iyi plaka) ekleyin.
- CSM zarı üzerine yerleşen sonra, dikkatlice HBSS aspire ve inci büyüme medya ekleme ve 700 uL içine besiyeri 300 uL ekleyinucun dışına e.
- Kültürü plakası içine eklemek CSM içinde büyüme ortamı ve tohum 200 uL uygun konsantrasyonda Pastör pipetiyle ASC (1 x 04-04 Ekim x 10 4). Kültürü insert içinde orta son hacim, tohumlama sonra, 500 uL olup.
- 37 azından% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş 24 saat süreyle CSM üzerine ASC tohumlu inkübe ° C.
5.. CSM içinde ASC Yükleme ve Hücre Uygulanabilirlik Yüzde Belirlenmesi
Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.
- Inkübasyondan sonra, insert membran içine göç etmiş hücreleri bozmadan steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne ASC yüklü CSM toplamak.
- Artık orta çıkarın ve tüp taze besiyeri 250 uL ekleyin.
- Her tüp 25 uL MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-il) -2,5-difeniltetrazolium bromür] eklemekçözeltisi (5 mg / mL) ve 37 azından% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş 4 saat süre ile inkübe edilir ° C.
- İnkübasyondan sonra, orta kaldırmak dimetil sülfoksit 250 uL ekleyin ve karmaşık formazan çözünürleştirmek için 2-5 dakika boyunca vorteks karışımı.
- 5 dakika boyunca 2700 x g'de santrifüje CSM, ve referans olarak 630 nm ile 570 nm de ölçüldü süpernatan absorbans belirler.
- Uygulanabilir ASC'nin bilinen numaraları elde absorbans değerine göre CSM ile ilişkili hücre numarasını belirlemek.
6. ASC-CSM-Gömülü Kolajen Jel Karakterizasyonu
Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.
- 2 N NaOH kullanılarak pH 6.8 'arındırılmış Bornstein 8 ve fibrillate yöntemine göre, fare kuyruk tendonu ekstrakte tipi 1 kolajen (7.5 mg / mL) karışımı ASC-yüklü CSM (5 mg ≈ 2 x 10 hücre ihtiva eden 4).
Bir 12-iyi levhaya fibrile kolajen-ASC-CSM karışımı ekleyin ve bir 37% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş azından 30 dakika süreyle inkübe edilir ° C. - Tam fibrilasyon sonra, 37 ° C kadar bir% 5 CO 2 nemli inkübatörde 14 gün için kolajen-ASC-CSM jeller inkübe
- Jel içine CSM gelen hücrelerin Yayın ve göç standart mikroskopi teknikleri kullanarak gözlenmiştir.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Bu çalışmada, bir kollajen jel iskele içine kitosan mikroküreler (CSM) kök hücre sunmak için bir in vitro bir strateji geliştirdik. Birörnek (çapı 175-225 mikron) ve kompozisyon Gözenekli CSM hücre taşıyıcıları (Şekil 2) olarak hazırlanmış ve kullanılmıştır. CSM'den ASC kuluçkaya üzerine, hücreler CSM 2 x 10 cells/5mg 4 arasında bir konsantrasyonda bağlı. Filopodia uzatırken hücreleri, mikroküre yayılan kabil edildimikroküre gözenekli yarıklar (Şekil 3) takın. Hücre yüklenmiş CSM kollajen jel ile karıştırılır edildi sonra, hücreler hemen jeller (Şekil 4) içine göç başladı.
Tablo 1. Bir kök hücre taşıyıcı sisteminde kitosan ve kollajen kullanımı için biyolojik avantajları.
Şekil 1. Şematik ASC-CSM yüklenen kollajen iskelelerinin çift kullanımı için genel bir strateji resmediyor. Şekil 2, 3, ve 4 görüntülerin yorumlanması ile yardımcı şematik içinde açıklamalı.
Şekil 2. Şematik kitosan mikroküreler üzerine kök hücrelerin tohumlu süreci resmediyor. Procmikron gözenek büyüklüğü membran kültür plaka insert - ess bir 8 CSM ile birlikte kültür ASC içerir. 24 saat sonra, mikroküreler ekleme kaldırılır ve bir biyomateryal matris içine almasi için hazırdır.
Şekil 3. ASC ile CSM yüklü morfolojik karakterizasyonu. B panelinden konfokal floresan mikroskobu ile elde edilen bir resim ile üst üste aynı görüş alanını gösterirken Panel A, ASC-yüklü CSM bir ışık mikroskobu resmediyor. ASC kalsein AM (yeşil) ile önceden yüklenmiş edildi. Panel D mikroküre (yıldız) yüklenmiştir hücreleri gösterirken Panel C, yüksüz bir mikroküre bir SEM görüntüsü bir görüntü resmediyor. Panel E TEM görüntü yüksüz mikrosfer bir kesitini göstermektedir. Gözenekler ve çatlaklar yapan çok sayıda mikroküre çapında bulunmaktadır. Panel F hücreleri ile kesitli mikroküre (oklar) eklenmiş ve CRE içine filopodia uzanan gösterirmengene. Orijinal büyütme: A & B = 70X; C = 500x, D = 2,000 x; E & F = 2,500 x.
Şekil 4. Üç boyutlu bir yapı iskelesi kollajen içine CSM gelen ASC göçü. Paneller A ve B hücreleri uzak mikroküre geçiş ve 3. günde kollajen matriks (A, oklar) içine CSM betimliyor. Panel B 12 gün sonra, benzer bir kültür gösterir. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleri C, D ve C ve D E. Asteriskler tasvir hücreleri mikroküre (oklar) uzak göç ile kesitli olan bir mikroküre göstermektedir. Panel D'nin yüksek büyütmede paneli E tasvir ve kollajen fibriller (ilave) hücresine bağlı filopodia gösterir. Orijinal büyütme: A & B = 100x; C & D = 6,000 x; E = 20.000 x, inset = 150,000 x.
Şekil 5.Şematik rejeneratif tıp ve ilaç teslim CSM geniş kullanım resmediyor.