Standart Mürekkep Püskürtmeli Yazıcı Kullanımı Geçici Hücre Zarı Gözenekler oluşturma

Özet

Bir bioprinter içine bir HP Deskjet 500 Yazıcı dönüştürmek için kullanılan yöntemlerin açıklaması. Yazıcı membran geçici gözenekler neden canlı hücreler, işleme kapasitesine sahiptir. Bu gözenekler baskılı hücrelerine flüoresan G-aktin dahil olmak üzere küçük moleküller, dahil etmek için kullanılabilir.

Özet

Bioprinting doku mühendisliği, doğrudan hücre uygulama terapileri, biyosensör mikroimalat içeren uygulamalar ve önemi geniş bir yelpazede, vardır. Son zamanlarda ^1-10, termal mürekkep püskürtmeli baskı Ayrıca gen transfeksiyon için kullanılmaktadır. ^8,9 termal mürekkep püskürtmeli baskı işlemi gösterildi geçici hücre canlılığı etkilemeden hücre zarlarını bozabilir. Membranında geçici gözenekler aksi hücre sitoplazmaya, membran geçmesi için çok büyük moleküllere olacaktır. ^8,9,11 tanıtmak üzere kullanılabilecek

Burada gösterildiği edilen uygulama hücrelerine floresan etiketli g-aktin monomerlerin birleştirmek için termal mürekkep püskürtmeli baskı kullanılmasıdır. Hücrelere moleküller enjekte etmek için termal ink-jet baskı kullanmanın avantajı tekniği hücreleri için nispeten iyi huylu olmasıdır. Baskıdan sonra ^{8, 12} Hücre canlılığı, standart hücre PLA benzer olduğu gösterilmiştirting yöntemleri ^1,8. Ayrıca, inkjet baskı manuel mikroenjeksiyon çok daha hızlı olan, birkaç dakika içinde hücrelerin binlerce işleyebilir. Baskı tarafından oluşturulan gözenekler yaklaşık iki saat içinde kapatmak için gösterilmiştir. Bununla birlikte, küçük bir protein ve / veya partikülleri hücreler enjekte etmek tekniği sınırlar Bu baskı tekniği ile (~ 10 nm) hazırlandı gözenek büyüklüğü bir sınırlama yoktur. ^8,9,11

Standart bir HP Deskjet 500 Yazıcı kaldırıldı ⁸ yazıcının ^{kapağı, 3, 5.} Hücre baskı sağlamak için değiştirilmiş ve kağıt besleme mekanizması mekanik bir kolu kullanılarak bypass oldu. Bir aşamada doğrudan baskı kafası altında mikroskop ve lamelleri yerleştirilmesi için izin vermek için oluşturuldu. Mürekkep kartuşları, açılmıştır mürekkep çıkarıldı ve hücreler ile kullanımdan önce temizlenmiştir. Baskı desen sonra basit bir yazıcı komutu ile yazıcının kontrol standart çizim yazılımı kullanılarak hazırlandı. 3T3 fibropatlamalar, izdiham büyüdü tripsinize ve sonra fosfat süspanse çözünür floresan etiketli g-aktin monomerler ile tamponlu tuzlu edildi. Hücre süspansiyonu mürekkep kartuşu pipetlendi ve hücre hatları cam mikroskop kapak slipleri üzerine basıldı. Canlı hücreler floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi ve aktin sitoplazma boyunca bulundu. Hücreye flüoresan aktin birleştirilmesi kısa zamanlı sitoskeletal dinamiklerinin görüntüleme için olanak sağlar ve geniş bir uygulama alanı için yararlıdır. ^13-15

Protokol

1. HP Deskjet 500 dönüştürme

Bu tekniğin bir çok ticari olarak mürekkep püskürtmeli yazıcılarla çalışmak gerektiğine dikkat edilmelidir. Ancak, yaşlı yazıcılar, onların kolayca yapışmasına neden olmayan daha büyük çaplı nozul ile mürekkep kartuşları, kullanmak daha iyi çalışma eğilimindeler. Ayrıca, eski yazıcıları atlamak için daha kolay olan mekanik kağıt besleme sensörleri kullanma eğiliminde. Optik sensörler ile Yazıcılar kandırdın ama her döngüsü sırasında yazıcının uzak kenarında küçük bir kağıt şerit kullanarak, ancak "hile" için mekanik sistem biraz daha zor olabilir. En iyisi şu anda piyasada bulunan yazıcılar düşük çözünürlük (DPI) var.

Yüksek çözünürlüklü yazıcılar daha kolay tıkanmasına eğilimindedir. HP Deskjet 500 çözünürlük 300 DPI olduğunu. 600 DPI çözünürlüğe sahip birçok ticari yazıcılar (HP Deskjet serisi ve diğerleri) vardır. Bu tip yazıcının nozul içinde sadece küçük bir artış ile birlikte kullanılabilirler(bölüm 3) dikkatli temizlik kullanılarak kontrol altına alınabilir sorunları tıkanma.

1. Yazıcının alt taban birkaç plastik klipleri Anahtarcı ve yavaş yavaş üst kapalı kaldırarak yazıcının üst plastik kasa çıkarın.
2. Yazıcının üst sökün düğmesi / ekran ışığı paneli, yazıcı anakartı bağlı bırakarak.
3. , Mürekkep kartuşu dayanır ve baskı oluşur, özellikle alanların Yazıcının içini temizleyin.
4. Kağıt besleme mekanizmaları güç sağlayan kablolar bulun ve anakart onları çıkarın.
   1. HP Deskjet 500, bu sadece ön sol tarafına kağıt tepsisi aşağıda verilmiştir.
5. Kağıt algılama mekanizması bulun. Bir dize veya manuel çekme kolu olarak hizmet tel döngü yapıştırılması tarafından mekanizması devre dışı bırakın.
   1. HP Deskjet 500, kağıt algılama mekanizması baskı / kağıt besleme mekanizmasının üstünde ve arkasında bulunan bir gri plastik kolu olduğunu.
6. Sadece kartuş yazıcı kafası altındaki bir seviyede istenen baskı slaytlar getirmek için kağıt besleme mekanizması (kağıt beslenen ve tevdi edilmesi yer) önünde bir sahne oluşturmak.
   1. Bizim deneyler için, 15 ml santrifüj tüpleri için köpük sevkiyat sahibi istenilen yüksekliğe slaytların son seviyeye getirmek için baskı bölgede yer bantlanmış birkaç mikroskop kullanıldı.
7. Aseptik teknik korumak için, yazıcının standart bir biohazard dolap veya masa laminer akış davlumbaz içine yerleştirilebilir.
8. Bu bir ticari ink-jet yazıcı değiştirerek genellikle yazıcının üretici garantisi unutmayın önemlidir.

2. Dönüştürme Stok HP Mürekkep Kartuşları (HP 26 Siyah mürekkep kartuşu)

1. Şu an için yazıcı temas ve baskı kafası kaplayan koruyucu bant bırakarak, ambalajından kartuşunu çıkarın.
2. Vücut stabilizeherhangi bir engel yeşil üst açık bırakarak, bir kelepçe veya mengene (sadece sıkıca genellikle iyi olarak çalıştı elle kartuş kavrama) ile ya kartuş (siyah kısım).
3. Pense veya ayarlanabilir bir anahtar kullanarak, kartuşun yeşil üst kavramak ve serbest kalıncaya kadar geri ve ileri birkaç kez çevirin.
   1. Bu kadar kuvvet almamalıdır, ancak üst artık gerekli değildir, bu yüzden çıkarırken Eğer tatili bu tamam.
4. Tornavida kullanarak, şimdi maruz şeffaf plastik parça kapalı gözetlemek.
   1. Yine, bu kadar güç almamalıdır, ama ihtiyaç olmayacaktır, bu yüzden çıkarılması sırasında bozulursa o tamam.
5. Herhangi bir rezervuar kalan boşaltın.
6. Yazıcı temas ve baskı kafası kaplayan plastik koruyucu bandı çıkartın.
7. Iyice su rezervuarları yıkayın.
   1. Kanallar yoluyla su itmek için bir pipet veya şırınga kullanın.
   2. Su olasılıkla sırasında baskı kafası gelen sızıntı yaparBu süreç, bu kabul edilemez ve kartuş işlevselliğini herhangi bir zarar vermez.
8. Su temiz çalıştığında, kartuş kurumasını bekleyin.

3. Kartuş Temizleme

1. Temiz bir baskı ortamda muhafaza etmek amacıyla, mürekkep kartuşları kullanımdan önce ve sonra temizlenir.
   1. Bu aynı zamanda tuzlar ve tıkanmalara neden olabilir kartuşta başka biyolojik madde kristalizasyon kaçınarak yardımcı olur.
2. Tamamen daldırın de-iyonize su dolu bir cam kapta kartuş, baskı öncesi ve sonrası 15 dakika ses dalgalarına maruz.
3. Sonication sonra, su kartuşu çıkarın ve fazla suyu silkeleyin.
4. Daha aseptik ortam yaratmak için kartuş içine Sprey% 70 etanol.
   1. Etanol bioink baskı çözümü eklemeden önce kuruduğundan emin.

4. Hücre Süspansiyon yapma - "Biomürekkep "

1. Geçit Kültür hücreleri kadar hazır.
   1. 3T3 fibroblastlann:% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile yaklaşık ⁴ 1.3x10 hücre / Dulbeco Modified Eagles Orta (DMEM) cm ² de T-75 şişe üzerine Tohum hücreleri. 37 küvözde iki gün boyunca Kültür hücreleri ° C ve% 5 CO _2.
2. Konsantrasyonda floresan g-aktin stok solüsyonu olun 50 mikrogram / Fosfat Tampon Çözeltisi (PBS) ml.
3. Passage hücreler.
   1. 3T3 fibroblast için: şişesi medyayı çıkartın ve PBS ile iki kez yıkayın. 5 dakika için 5 ml% 0.25 tripsin + EDTA ve inkübe hücreler örtün.
   2. Taze aracı madde 5 ml ilave edilir ve 5 dakika boyunca 1000 rpm'de, 15 ml konik bir santrifüj tüpüne ve santrifüj içine hücre süspansiyonu Pipeti. Aspirat orta geçirdi.
4. Bioink oluşturmak için flüoresan g-aktin stok solüsyonu ile PBS içinde yeniden süspanse hücreleri.
   1. Bioink 10 ug / ml ve bir hücre co-aktin g arasında bir nihai konsantrasyona sahip olmalıdır1x10 ⁵ hücre / ml ncentration. Bu yoğunlaşma yazıcı kafa damla ve tıkanma başına hücre miktarını sınırlamak için optimize edilmiştir. ⁸
   2. Bioink 250 ul Şekil 2'de gösterildiği gibi kalıp ile üç kapak slipleri basar dikkat ediniz.

5.. Bioprinting

1. Güç ve yazıcı ısınmasına izin verin.
2. Yer adım 1.6 hazırlanmış sahnenin üzerine (burada, biz 22 mm x 22 mm lamelleri kullanın) baskı yüzeyi istenen.
3. Bir baskı desen dosyası oluşturun.
   1. Açık Microsoft Word (veya başka bir çizim yazılımı) ve istenilen desen çizin.
   2. Premade dosyasında hücre baskı için istenen bir baskı desen seçin.
4. Istenilen hücre süspansiyonu ile hazırlanmış kartuş yükleyin.
   1. Iyi kartuş yuvasının altındaki küçük dairesel pipetleyin süspansiyon. Çözüm yaklaşık 100-120 ul kullanın. Baskılı damla boyutu 130 civarındadırpikolitre. ⁸
5. HP Deskjet 500 Yazıcı ile dosyayı yazdırın.
   1. En iyi sonuçlar için, kelime işlemci programında istenen kopya miktarını değiştirerek, küçük desenleri birkaç kez (5) yazdırın.
6. Yazıcı yine coşturacak, sonra kartuş "hazır" konumuna hareket edecektir.
7. Kartuş hazır pozisyonu (biraz çok altında mürekkep damla solunda ve orada kalır) taşındığında, kağıt besleme mekanizması tel üzerinde yukarı çekin ve baskı başlamalıdır.
   1. Baskı birden fazla kopyası için, kağıt besleme mekanizması her döngüde veya sayfa yazdırılıyor sonra serbest gerekecektir. Kartuş sonra "hazır" konumuna geri döner ve kağıt besleme mekanizması tel tekrar yükseltilmelidir.
8. Yazıcı (bkz. Şekil 2) adım 5.2 baskı Sahnenin ortasına yerleştirilen coverslip üzerine basacaktır.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Standart, off-the-raf HP Deskjet 500 Tüm dönüşüm sürecinin temsilcisi sonuçları, standart HP 26 serisi kartuşları önce de belirtildiği gibi, analiz birçok türleri için hücre baskı çözümleri yeteneği ile bir yazıcı oluşturur. Dönüşüm sonra tamamlanmış yazıcı üzerine mikroskop kapak kayma yerleştirmek için bir baskı aşaması ile, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Yazıcı da dahil olmak üzere, birçok alanda analiz yararlı olduğu ancak bunlarla sınırlı değil: tek hücre mekaniği, doku mühendisliği, gen transfeksiyon, biyosensör micropatterning ve doğrudan hücre tedavileri ^{1-10, 16-22.}

Bu örnekte, bir HP Deskjet 500 Yazıcı serisi ve HP 26 mürekkep kartuşları bioprinting için modifiye edilmiştir. Bir g-aktin monomer çözeltisi içinde fibroblast hücre süspansiyonu oluşan bir bioink bu yazıcı kurulumu kullanarak, hücreleri cam mikroskop lamelleri üzerine basıldı. Şekil 1 temsilcisi res göstermektedir dahil floresan aktin monomerlerin göstermek basılı fibroblast hücrelerinin ults. Sonuçlar hücreleri özelleştirilebilir kalıpları içine baskılı edildiği kontrollü bir ortamda aseptik olarak elde edildi.

Bu örnekte kullanılan desen Microsoft Word (Şekil 2) oluşturuldu. Bu kalıp mikroskop sürgünün çoğunluğu boyunca baskı çözeltisi kesintisiz bir hat hazırlandı. Şekil 4 bioink ve hücreler karşılıklı tevdi edildiği düz çizgi gösterir. Bu hücreler asılı olduğu bioink çözeltisi, serbest aşırı flüoresan aktin monomerler içerdiğinden hemen baskıdan sonra, arka floresans bir artış olduğunu belirtmek gerekir. Bu arka floresans önemli ölçüde substrat aşırı monomer yıkayan hücreleri (Şekil 1), üzerinde büyüme ortamının eklenmesinden sonra azalır.

ad/3681/3681fig1.jpg "/>
Şekil 1. 3 saat değiştirilmiş inkjet yazıcı kullanarak baskı sonrası 3T3 fibroblast Temsilcisi görüntüler. Hücre içi dahil floresan etiketli aktin monomerler göstermektedir. Ölçek çubukları 50 um temsil eder.

Şekil 2. Bioink yazdırmak için kullanılan tasarım.

Şekil 3. Strafor evre dönüşüm sonra Yazıcı. Ortasında turuncu tel kağıt besleme kolu sensörü atlar.

Şekil 4. Yerelleştirilmiş bir baskı bölgesi basılmış 3T3 fibroblast Temsilcisi görüntü. Mikroskopi görüntü 20x büyütmede yazdırdıktan sonra 5 dakika alınır.

/ Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg "/>
Şekil 5. 3 saat içselleştirilmiş floresan aktin monomerler ile fibroblast gösteren baskı sonrası alınan Floresans görüntüsü (40x büyütme). Ölçek çubuğu 50 um temsil eder.

Şekil 6. 15 dakika baskı sonrası alınan bir hücrenin Floresan mikroskobu (20x büyütme). Görüntü hem de g-aktin (yeşil) ve çekirdek (mavi) gösterir. Soldan sağa: g-aktin Alexa Fluor 488 ile, nükleus DAPI, hem de bir kaplamaya sahip.

Şekil 7. 3 saat baskıdan sonra bir çizgi desen iki fibroblastlar gösteren Floresan mikroskopi. Soldaki Resim hücrelerin içinde floresan ile işaretlenmiş aktin monomerlerin gösterir. Sağdaki resim göstermek için arka plan görüntüsü ile floresan kanalın bir yerleşim olmasına rağmen buSlayt (sol alt köşe) bazı enkaz olabilir, bu floresan değil. Boyutu sağ floresan etiketli monomerler ile 3 saat süreyle inkübe basılı olmayan bir hücre Kontrol grubu olduğunu belirtti değilse Ölçeği barlar 50 um temsil eder. Bu kontrol monomerler hücre baskı ile membran geçirgenliği olmayan hücre zarı nüfuz edemediği göstermektir.

Tartışma

Bioprinting için standart bir mürekkep püskürtmeli yazıcı masaüstü dönüştürme işlemi oldukça zor değildir. En zorlu adım kullanılan yazıcının marka ve modeline bağlıdır kağıt besleme mekanizmasını atlatmak, nasıl belirliyor. Burada tarif edildiği gibi kağıt besleme sensörü mekanik olduğunda Bununla birlikte, bu oldukça basittir. Optik sensörler yem modellerde, diğer teknikleri de kağıt kullanıyor düşünce içine Yazıcı kandırmak için istihdam gerekebilir; bu mikroskop lamı üzerine baskılar ise örneğin, bir yazıcı ile küçük bir kağıt parçası çalıştırabilirsiniz. Kağıt besleme mekanizması atlayarak farklı yazıcı modelleri bu işlemleri uygulayarak en zor adım olması muhtemeldir.

Baskı için lamelleri tutmak için bir sahne inşa zaman, düzgün hizalama ve yükseklik sağlamak önemlidir. Aşaması baskı alanı ortasında yerleştirilmesini coverslip olanak vermelidir. Buna ek olarak, pl gerektiğiyeterli bir yükseklikte as coverslip yazıcı kartuşu için boşluk o bozmadan slayt üzerinden geçmesine izin vermek için. Sahnenin tam yüksekliği yazıcı modeline bağlı olacaktır.

Basılı hücreleri yıkanmasını alamadım sağlamak için, slaytlar hemen ek hücre büyüme ortamı eklendi önce hücre eki için izin vermek için yaklaşık 30 dakika boyunca baskı sonrası bir kuluçka yerleştirildi. Hücreler PBS büyük miktarda hücrelerin kurumasına ve canlı kaldı içeren bir çözüm basıldı çünkü. Hücreler, hücre (5-7, Şekil 1,) içindeki etiketli g-aktin monomerlerin dağılımı görselleştirme floresans mikroskobu kullanılarak görüntülenmiştir. 3T3 fibroblastlar ile baskı zaman, Şekil 5 aktin floresan için hücre daha neden, fakat yüksek parlaklıktaki çizgiler ile sergileyen, temsili bir sonucunu göstermektedir. Floresan hücre iskeletinin içine g-aktin etiketlenen birleşme olduğunusitoskeletal dinamikleri ve hücresel mekaniğinin çalışması için faydalıdır. ^12-15 Bu tekniğin bir sınırlaması yaklaşık 10 nm den daha küçük çaplara sahip moleküller ve proteinlerin sadece uygulanabilir olmasıdır.

Bu hücreler, aslında dönüştürülür yazıcı tarafından işlenen edildi sağlamak için, DAPI (PBS içinde 1:5000) saf PBS hacminin yarısına yerine bioink ilave edildi. Flüoresan leke DAPI çekirdek içinde bulunan DNA amino asit zengin porsiyonlar bağlanır. Bu nedenle DAPI baskılı hücrelerin floresan görüntüleme çekirdekler yararlı bir leke olduğunu. Şekil 6 Alexa Fluor 488 (aktin) ve hem de bir bindirme görüntü ile DAPI (nükleus) floresans hem de gösteren bir hücre temsilcisi görüntüsünü gösterir. Şekil 7 de verilmektedir Örnek içine tevdi edilmiş, biyolojik olmayan materyal, çünkü absenc bir floresan olmayacak ederken hücreleri g-aktin monomerler dahil edilmiştir kez floresan olacaktırg-aktin monomerlerin e.

Bioprinting için önemli bir göz bioink için kullanılan sulu bir ortamdır. Bu serum ile standart hücre büyüme ortamını kullanarak tutarsız sonuçlar vermiştir bulunmuştur. Bu büyük olasılıkla serum proteinlerinin tarafından baskı kafası memelerin tıkanmasına bağlıdır. PBS kullanımı baskılı desenler tutarlılığı artmış ve hücre sayısı yatırılır. PBS kullanarak bir dezavantajı hücrelerin uzun süre için askıya bırakılmamalıdır olmasıdır. Ancak, bu örneklerin fibroblastların hücre canlılığını hiçbir değişiklik ile en az bir saat bioink koşullarına tahammül başardık. Bu termal mürekkep püskürtmeli mekanizmalar üzerinden basılan hücreler yüksek canlılık oranına sahip olduğu gösterilmiştir rapor, önceki birkaç bulguları ile tutarlıdır. ^2-8

Bu modifiye yazıcı kurulum hücre baskı dışındaki uygulamalar için de kullanılabilir. Gibi kolajen ya fibrone olarak ^16-22 matris proteinlerine,ctin, kolaylıkla hücre desenlendirme için yararlı olabilir bu teknik ile yüzeyler üzerine basılabilir. Örneğin, kolajen tip I hattı kalıpları içine büyüme faktörleri gibi matris proteinlerine, diğer moleküllerin, ek olarak in vitro hücre kültürü çalışmalarda. ¹⁷ için kullanılabilir hizalanmış kollajen yüzeyler ile sonuçlanacaktır baskılı, güvenilir bir hücre çalışmaları için yüzeyler üzerinde lokalize edilebilir ve potansiyel terapötik uygulamalar. ¹⁸

Yukarıdaki adımları açıklanan tasarım önemli bir kısıtlaması, bu yazıcının birden fazla boyutta baskı yeteneğine sahip olmadığıdır. Bu tür iskelesi baskı gibi desenli uygulamalarda kullanım için potansiyel sınırlar. 3D baskı için izin vermek için, özel bir aşamada kullanılmak üzere ihtiyaç duyar. Sahne bioink tabaka-by-katman birikimi için artan yükseklik ayarlı olması gerekir.

Bioprinting doku mühendisliği için verimli ve maliyet etkin bir yöntem olarak söz göstermiştir, Gen transfeksiyon, micropatterning ve mikroarray fabrikasyon ^{1-12, 16-22} cihaz bu tip gelecekteki uygulamalar da dahil olmak üzere, çok fazladır. Iskeleler üzerine kontrol ve desenli mikro hücresel, hücre sitoplazmaya makromoleküllerin birleşme ve hücrelerin birikimi oluşturulması ve doğal ya da verimli bir şekilde meydana gelmez yapılar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HP Deskjet 500	Hewlett-Packard	C2106A	Üreticinin Durduruldu. Yenilenmiş Aralık Trader satın aldı.
HP 26 Siyah Mürekkep Kartuşu	Hewlett-Packard	51626A
Tavşan kas aktin, Alexa Fluor 488 konjuge, 200 mikrogram	Invitrogen	A12373
Fosfat Salin (PBS) Tamponlanmış	MP Biomedicals	ICN1860454
Dulbeco Modified Eagles Medium (DMEM)	Thermo Scientific	SH3002201
Sığır fetüs serumu	Sigma-Aldrich	F4135
Amfoterisin B	Sigma-Aldrich	A2942	Hücre kültür ortamında% 0,5 ikinci
Penisilin-Streptomisin	Sigma-Aldrich	P4333	Hücre kültür ortamında% 0,5 ikinci
Tek Yönlü Akış Temiz Tezgah	Envirco	VLF 797	Yazıcı aseptik tutmak için opsiyonel konut