Monositler ve İnsan Kan Küçük Örneklerden Dendritik Hücrelerde Lineage özgü Toll-like reseptör-aracılı Sinyali Kantitatif Görüntüleme

Summary

Biz (ImageStream teknolojinin kullanıldığını anlatmak Www.amnis.com), Hangi iyi tanımlanmış hasta kohortlarında primer immün hücrelerinin hücresel mekanizmaları ölçmek için, aynı anda yüksek-çözünürlüklü dijital görüntüleme ile kantitatif akım sitometri birleştirir. Çalışmalarımız konu kohortlarında küçük örneklerde soyunun spesifik hücresel tepkileri ölçmek için translasyonel araştırmalar için bir plan sunar.

Abstract

Bağışıklık durumu bireysel farklılıkları enfeksiyona yanıtların saptanması ve hastalığın ciddiyeti ve sonuçları katkıda bulunmaktadır. Yaşlanma viral ve bakteriyel enfeksiyonlara karşı artmış duyarlılık ile ilişkili ve humoral iyi belgelenmiş düşüşün yanı sıra hücre-aracılı bağışıklık yanıtı ^1,2 ile aşılara yanıt azalır. Biz son zamanlarda Toll benzeri reseptörler (TLR), mikrobiyal enfeksiyon ve tetik antimikrobiyal konak savunma yanıtları ³ algılamak doğuştan gelen bağışıklık sisteminin kilit bileşenleri üzerindeki yaşlanma etkilerini değerlendirdik. Sağlıklı insan donör büyük bir kohort, biz yaşlılar o periferik kan monosit ifade ve belli TLR ⁴ ve dendritik hücreler benzer düşük TLR düzeyleri ve sinyalizasyon yanıtları (DC) fonksiyonu azalmış gösterdi, hayati önem taşıyor hücreler antijen sunan doğal ve kazanılmış bağışıklık ⁵ arasındaki bağlantı. Biz bir makrofajlarda TLR3 bozulmasına göstermiştirBatı Nil virüsü ^6,7 enfeksiyonuna yanıt olarak yaşlı donörlerden DC'lerin IFN d düşük üretim.

Immunosenescence anlayışımıza ve terapötik müdahale Paramount yanıt spesifik hücre tiplerinin ayrıntılı bir anlayış ve sinyal iletim mekanizması (s). FACS veya immunoblotting tarafından birincil hücre ve hücre ölçme belirteçlerin görüntüleme yoluyla bağışıklık yanıtları Geleneksel çalışmaları Ancak, bu çalışmalar genellikle hastalar mevcut küçük bir örnek hacmi ve birden çok karmaşık laboratuvar teknikleri yapmak yetersizlik teknik sınırlıdır, önemli ölçüde bizim anlayış gelişmiş var insan örnekleri. ImageStream eş zamanlı yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme ile kantitatif akım sitometri birleştiriyor ve böylece hasta duyarlılığının etkin bir şekilde yakalamak için eş zamanlı birden fazla hücre popülasyonlarının araştırılması kolaylaştırır. Burada DC'ler içinde ImageStream kullanımını değerlendirmek için göstermek TLR7 / 8fosforilasyon ve immün yanıtı ⁸ için kritik olan çok sayıda gen transkripsiyonu başlatan önemli bir transkripsiyon faktörü NF-KB, nükleer translokasyonu aktivasyon aracılı artar. Biz de son zamanlarda TLR5 sinyalizasyon ve ⁹ yaşlanma değişmiş immün yanıt katkıda bulunabilir yaşlı donörlerden monositlerde NF-KB yolunun daha önceden tanınmayan değişiklik gösterdiği, bu teknoloji kullanma.

Protocol

1. Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve uyarılması

1. Yerel Kurumsal Değerlendirme Kurulu kuralları uyarınca yazılı onam sonra sağlıklı gönüllülerden alınan 10-50 ml heparinize kan edinin. Yaşlanma veya hastalık çalışmalar için her bir gönüllü veya hasta için patogenezi, etme ve dışlama kriterleri açıkça belirlenmelidir.
2. CPT tüpler veya Ficoll-Paque kullanarak Plus, izolasyon ⁷ (Reaktifler, Tablo 1) gününde üreticinin talimatlarına (GE Healthcare, NJ) ve Deney göre insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) ayırın.
3. Inkübe PBMC'ler (3 x 10 ⁶ / tüp) tek başına ortam içinde 0.6 ml 1.5 ml tüpler içeris....

Discussion

Translasyonel çalışmalar ImageStream kullanımında önemli adımlar uygun karşılaştırma grupları ve optimizasyonu ve antikor özgüllük doğrulama seçimi vardır. Etiketli hedef konu grupları arasındaki farklar histogramlar ve hücre görüntüler arasında kolayca belli olacak. Ilgili reseptörler ve sinyal yolları değişikliklerin ayrıntılı bir analiz ile birlikte, bu veriler özel kohortlarında bağışıklık bozukluğunun altında yatan mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlayacaktır. Tekniği ilgili hedefler için yeterli yakınlık s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
Ficoll-Paque Artı	GE Healthcare	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-r848
Paraformaldehit (16%)	Elektron Mikroskopi Bilimleri	15710
BD Perm / Yıkama	BD Biosciences	554723
CD14-PE	eBioscience	12-0149-41
CD4-PacBlue	BD Pharmingen	68436
Lineage kokteyl 1 (lin 1)-FITC	BD Biosciences	340546
CD11c-PE	BD Biosciences	347637
CD123-PE	BD Biosciences	340545
tavşan anti-NF-KB (p65)	Santacruz	SC-372
Alexa647 F (ab ') 2 keçi anti-tavşan IgG	Invitrogen	A21246
DAPI	Invitrogen	D21490
ImageStream X	Amnis

Hücre tipi	FITC	PE	Alexa 647	PacBlue
Monosit		CD14	NF-KB (p65)
MDC	Lin1	CD11c	NF-KB (p65)	CD4
PDC	Lin1	CD123	NF-KB (p65)	CD4