TransFLP - Genetiği değiştirmek için bir yöntem Vibrio cholerae Doğal Dönüşüm ve FLP-rekombinasyon sonucu

Summary

Arasında genomunu değiştirmeye hızlı bir yöntem V. cholerae Tarif edilmektedir. Bu değişiklikler tek genlerin, gen kümeleri ve genomik adaları gibi kısa dizileri (örn. promotor elemanlarına veya benzeşim-etiket dizileri) ve entegrasyon silme içerir. Yöntem, doğal transformasyon ve FLP-rekombinasyon dayanmaktadır.

Abstract

Çeşitli yöntemler bakteri kromozomu ^1-3 işlemek için kullanılabilir. Bu protokollerin çoğu (örneğin, pir-bağımlı veya ısıya duyarlı Replikon ^1,2 yataklık) şartlı replikatif plazmid ekleme güveniyor. Bu plazmid homoloji-aracılı rekombinasyon bazlı bakteri kromozomu içine entegre edilmiştir. Bu tür mutantlar insersiyonal çoğu kez direkt olarak deney ortamlarda kullanılır. Alternatif olarak, onun kaybı, ardından plazmid çıkarılması için seçim sık sık SACB gen tarafından kodlanan ⁴ karşı tarafından seçilebilir levan sukraz enzimi dayanır Gram-negatif bakteriler için, hangi gerçekleştirilebilir. Eksizyonu ya da ön-yerleştirme genotip ya da kromozom ve modifiye geninin plazmid ile kodlanmış kopya arasında bir değişim ile sonuçlanır geri olabilir. Bu yöntemin bir dezavantajı, zaman alıcı olmasıdır. Plazmid ilk klonlanmış gerekmektedir; bunu V. içine yatay transferi gerektirir cholerae (en fazla n otably E ile çiftleştirilerek coli suşu verici) ya da ikinci bir yapay dönüştürülmesi; ve plazmid eksizyonu ve rasgele ya da ilk genotip geri ya da herhangi bir pozitif seçim sarf edilir ise, istenen değişikliği oluşturabilir. Burada, V. hızlı manipülasyon için bir yöntem mevcut cholerae kromozom (lar) ⁵ (Şekil 1). Bu TransFLP yöntem, V. gibi cins Vibrio bu organizmanın ⁶ ve diğer temsilci doğal yetkinlik yeni keşfedilen kitin-aracılı indüksiyon dayanmaktadır fischeri ^7. Doğal yetkinlik PCR tarafından oluşturulan DNA parçaları dahil olmak üzere ücretsiz DNA alımını sağlar. Bir kez alınır, DNA homolog bölgenin ⁸ sınırdaş 250-500 bp asgari varlığını verilen kromozomu ile yeniden birleştirilmesi kastedilmektedir. Bu komşu bölgeleri arasındaki bir seçim işaretleyici İçeren sık görülen transformantlar kolay algılanmasını sağlar. T "> Bu yöntem, V. cholerae, farklı genetik manipülasyonu için kullanılabilir ve potansiyel olarak da diğer doğal olarak yeterli bakteri olabilir. bizim daha önce yayınlanmış bir gen silme üzerinde çalışma ve ek olarak, bu yöntem tarafından gerçekleştirilebilir ne üç yeni örnekler sağlamak benzerlik etiketlenmesi sekansları ⁵ ek. kitin kaynaklı doğal dönüşüm ⁶ başlangıç ​​protokolünü ilgili birçok iyileştirme adımlar bu TransFLP protokol içinde bu buluşa katılmıştır. Bunlar, diğerlerinin arasında ticari olarak mevcut kitin pul ^8, PCR tarafından yardım yengeç kabuk parçalarından replasman, madde ^9, ve FLP-rekombinasyon hedef sitesi (FRT) ⁵ transforme ilave olarak türetilmiş DNA. FRT sitesi FLP rekombinaz ¹⁰ tarafından aracılık seçim işaretleyicinin her bölge-yönlendirmeli eksizyon izin verir.

Protocol

TransFLP yöntem (Şekil 1) üç farklı yaklaşımlar ile örneklenmiştir: I), V nin ölümcüllüğünün belirleyicilerini kodlayan genin iki bitişik silme cholera (örneğin, ΔctxAB), II) bir patojenisite ada (örn., ΔVPI-1) çıkarılması ve III) T7 RNA polimeraz promotörü sekans bağlı olan entegre bir gen yukan-of-ilgi, daha sonra izin veren, ilgili gerginlik arka planda yapay ifadesi (örneğin, T7-tfoX) (Şekil 2).

1. Chitin Taneli hazırlanması

1. Standart bir 1.5 ml plastik tüp içinde kitin gevreği ağırlığı 50-80 mg. Bu, toplu olarak hazırlanabilir. Chitin pul Sigma (kat. numarası C9213) dan ticari olarak temin edilebilir.
2. Tüplerin kapaklarını açık tutarak gevreği otoklavlayınız.
3. Otoklav soğuduktan hemen sonra kapaklarını kapatın.
4. Mağaza otoklavlanmış kitin gevreğioda sıcaklığında.

2. Opsiyonel: V. Yapay Dönüşüm FLP Rekombinaz kodlama Plazmid ile cholerae

1. Electrocompetent hazırlayın V. standart yöntemler kullanılarak ¹¹ cholerae hücreleri. -80 Yetenekli hücrelerin alikotları saklayın ° C.
2. Electrocompetent plazmid pBR-bdp ⁵ düzenli bir mini hazırlık 1-2 ul ekleyin V. cholera hücresi ve bir elektroporasyon küvetine (0.2 cm boşluk genişliği) karışımı içine aktarın.
3. 1.6 kV bir darbe uygulayın.
4. 0.9 mL SOC orta ekleyin, hafifçe bir standart 14 ml tüp hücre aktarın. 30 2,5-3 saat süreyle hareketsiz inkübe ° C.
5. Levha 100 ul ve 30 ° C'da gece boyunca 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB ve inkübe plakalar üzerinde 300 ul.
6. Gelecekte TransFLP deneyler için gliserol stok olarak tek bir klondan ve mağaza arındırın.

3. Oligonükleotid Tasarım ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu

1. En az altı oligonükleotidler ilgilenilen DNA bölge (ler) de olduğu gibi PCR ile FRT yanlı antibiyotik kaseti (Şekil 3) yükseltmek için gereklidir. Aynı zamanda eklenen PCR parçası dış astar oligonükleotidler bir çift eklemek için tavsiye edilir. Bu entegrasyon ve FRT-sardığı antibiyotik direnç kasedi (örn. Şekil 3 ila 5 'chk-up' ve 'chk-down' primerleri olarak tasvir) doğru eksizyon için kontrol sağlar.
2. Oligonükleotidler # 2, # 3, # 4 ve # 5 dikkatle tasarlayın. Onlar yeterince şablon DNA (örn. ~ 28 bp) tavlama gerekir. Şablon DNA primerleri için genomik DNA (gDNA) gibi pROD17 ¹² ve pBR-FRT-KAN-FRT (Bu çalışma) primerleri için # 3 ve # 4 (gibi # 2 ve # 5 ve FRT-Kan-FRT-içeren plazmid DNA Şekil 3A).
3. Izin # 5 primerler # 2 tasarımı sırasıyla, # 2 / # 3 ve # 4 / # 5 arasındaki 5'-uç taban eşleştirme geniş (Şekil 3A inset). PCR İki mermi izleyin.
4. PCR ^1. yuvarlak olarak üç bağımsız PCR reaksiyonları gerçekleştirin. Ilk olarak bir oligonükleotidler # 1 ve # 2 yardımıyla gen / DNA bölge-of-ilgi yukan bölgesi yükseltecektir. PCR hücreleri içinde homolog rekombinasyon izin vermek için uzunluk olarak en az 500 bp'lik bir fragmanı ile sonuçlanmalıdır. Shorter parçaları (~ 250 bp) yeterli ⁸ olabilir ama tavsiye edilmez.
5. Paralel olarak FRT-sardığı antibiyotik kaset yükselterek ikinci PCR gerçekleştirmek. Örnekler burada sağlanan için biz esas aph (kan ^R) kullanılmıştır. Kullanım oligonükleotidler bu reaksiyon (Şekil 3A) için # 3 ve # 4.
6. Eş zamanlı PCR (üçüncü örnek) tarafından aşağı DNA bölgesinde yükseltmek. PCR parçası da uzunluğu en az 500 bp olması gerekir. Şablon ve oligonükleotidler # 5 ve # 6 (Şekil 3A) gibi gDNA ile PCR gerçekleştirin.
7. Her üç PCR saflaştırma sonrasındafragmanlar, PCR ^2. turda gerçekleştirmek. Şablon olarak ilk turda elde edilen her üç parçaları eşit karışımı kullanın. Amplifikasyon oligonükleotidler # 1 ve # 6 tarafından katalize edilir. Ortaya çıkan PCR parçası (Şekil 3B) doğal transformasyon deneyi (Şekil 1) DNA dönüşüm olarak hizmet vermektedir.

4. Chitin indüklenen Doğal Dönüşüm

1. Büyümek V. 30 zengin besiyerinde aerobik cholerae hücreleri ° C de yaklaşık 0.5 600 nm'de absorbansı ulaşana kadar.
2. Santrifüjleme ile hasat bakteri. DASW 2 cilt hücreleri resuspending önce tanımlanan yapay ortam (DASW ⁶⁾ kez pelet yıkayın. Steril kitin gevreği (nokta 1 altında açıklanan) 50-80 mg kültürü 1 ml ekleyin. Kültür ise bakteriler liman plazmid pBR-bdp (opsiyonel noktası 2), eklenti ampisilin (50 mg / ml). Hareket olmadan 16-24 saat süre ile 30 ° C'de inkübe edin.
3. G & Eklee; ^2. boyunca PCR-türetilmiş fragmanı (Madde 3 altında açıklanmıştır) 200 ng. Yoğun kitin yüzeylerinden bakteri sökmeden dikkatlice karıştırın. Hareket olmadan 24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
4. ≥ 30 sn için yoğun Vorteks kültür. Seçici LB besiyeri yaprakları (burada sağlanan örnekler örneğin kanamisin veya gentamisin içeren LB plakalar) üzerine 100-300 ul yayılır. Bakteri diğer antibiyotiklere beraber ampisilin ekleyerek pBR-bdp plazmid liman eğer çift seçici tabak kullanın. 16-24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe plakaları veya koloniler görünür oluncaya kadar.
5. Seçici plakaları tek transformantlar ayırın. Böyle transformantlar çift çapraz olay nedeniyle PCR parçası tarafından özgün kromozomal lokus yerini almıştır. Antibiyotik kaset kaldırılması gerekli değildir, ve dolayısıyla bu suşlar direkt olarak başka deneyler için de kullanılabilir.

5. FLP tarafından Seçici Kaset giderimi (ler)-Rekombinasyon

1. Doğal dönüşümü tahlilinden önce yapmadıysanız 2. maddede açıklandığı gibi yapay pBR-bdp plazmid ile transformantlar dönüşümü.
2. 16-24 saat boyunca 37 ° C'de ampisilin içeren LB agar plaklarına bakteriler büyümek. Seçenekler: 40 2-3 saat süreyle arasındaki sıcaklık değiştirmek ° C plazmid pBR-bdp den bdp ifadesi olarak yüksek sıcaklıklarda ^5,10 de-de bastırılanlardır; yakl taze plakaları transfer bakteri. Inkübasyon 8 sa.
3. Antibiyotik içeren ve antibiyotik içermeyen agar plaklarına paralel klonlar restreaking tarafından; antibiyotik duyarlılık (Şekil 1 kanamisin için buraya gösterdi) için test. Tek duyarlı koloniler izole edin. Eğer daha başka silme / TransFLP kullanarak ekleme ile gerginlik değiştirmek istiyorsanız, gliserol stok olarak ampisiline dirençli klon dondurun.

6. Plazmid Kür

1. Aerobik koşullar altında gecede kültür büyütün ve30 ° C'de Herhangi bir antibiyotik ilave olmadan zengin ortamı kullanın.
2. Opsiyonel: Taze antibiyotik içermeyen ortamda gecede kültürü 1:100 sulandırarak 3-6 saat süreyle taze kültür büyütün.
3. Levha veya çizgi düz LB agar plaka (lar) kültür seyreltme (lar) ve 30 inkübe ° 8-16 saat süreyle C (koloniler görebilir kadar).
4. Antibiyotik içeren ve antibiyotik içermeyen agar plakaları (Şekil 1) üzerinde paralel olarak klonlar restreaking ile klon ampisilin-duyarlılık için test edin. Gliserol stok olarak ampisilin duyarlı suşu dondurun.

Results

Üç örnek Örnek 6 için sonuçlar Şekil 4'te gösterilmiştir. İlk yaklaşım komşu genlerin CTxA ve ctxB silinmesi hedeflenmiştir. Birlikte V. önemli virulans faktörü kodlayan cholerae kolera toksin. Yukarıda tarif edilen ve Şekil 3'e uygun olarak biz TransFLP yöntem için oligonükleotidler tasarlanmıştır. Ebeveyn zorlanma, ctxAB orijinal DNA lokusu ve ctxAB için silinir ve direnç kasedi kurtulmuş nihai gerilimlerde FRT-sar...

Discussion

TransFLP yöntemi ⁵ yoğun laboratuarımızda kullanılmıştır yukarıda ve yerde anlatılmıştır. Mümkün olan genetik manipülasyon tür diğerlerinin yanı sıra şunları içerir: tek genler ve gen kümelerinin silinmesi, genomik adalar silme (örn., VPI-1), ilgilenilen bir gen (örneğin, promoter dizileri) yukarı akış yönünde dizilerin yerleştirilmesi ve ekleme , belirli bir gen (örneğin, kodlama afinite etiketleri) sonunda dizileri.

TransFLP için önemli bir önkoşul ve ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Chitin gevreği	Sigma	C9213	Gerekli Otoklavlama
İSTEĞE BAĞLI: Micropulser (durumda antibiyotik kaset pBR-bdp kodlanmış FLP Rekombinaz tarafından eksize edilmesi gerekir)	BioRad	165-2100	Veya karşılaştırılabilir electroporators