TransFLP - Genetiği değiştirmek için bir yöntem<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Doğal Dönüşüm ve FLP-rekombinasyon sonucu

Melanie Blokesch

doi:10.3791/3761

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

TransFLP - Genetiği değiştirmek için bir yöntem

14K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/3761

⸱

8 Ekim 2012

Melanie Blokesch¹

¹Global Health Institute, School of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Bu makalede

Özet

Arasında genomunu değiştirmeye hızlı bir yöntem V. cholerae Tarif edilmektedir. Bu değişiklikler tek genlerin, gen kümeleri ve genomik adaları gibi kısa dizileri (örn. promotor elemanlarına veya benzeşim-etiket dizileri) ve entegrasyon silme içerir. Yöntem, doğal transformasyon ve FLP-rekombinasyon dayanmaktadır.

Özet

Çeşitli yöntemler bakteri kromozomu ^1-3 işlemek için kullanılabilir. Bu protokollerin çoğu (örneğin, pir-bağımlı veya ısıya duyarlı Replikon ^1,2 yataklık) şartlı replikatif plazmid ekleme güveniyor. Bu plazmid homoloji-aracılı rekombinasyon bazlı bakteri kromozomu içine entegre edilmiştir. Bu tür mutantlar insersiyonal çoğu kez direkt olarak deney ortamlarda kullanılır. Alternatif olarak, onun kaybı, ardından plazmid çıkarılması için seçim sık sık SACB gen tarafından kodlanan ⁴ karşı tarafından seçilebilir levan sukraz enzimi dayanır Gram-negatif bakteriler için, hangi gerçekleştirilebilir. Eksizyonu ya da ön-yerleştirme genotip ya da kromozom ve modifiye geninin plazmid ile kodlanmış kopya arasında bir değişim ile sonuçlanır geri olabilir. Bu yöntemin bir dezavantajı, zaman alıcı olmasıdır. Plazmid ilk klonlanmış gerekmektedir; bunu V. içine yatay transferi gerektirir cholerae (en fazla n otably E ile çiftleştirilerek coli suşu verici) ya da ikinci bir yapay dönüştürülmesi; ve plazmid eksizyonu ve rasgele ya da ilk genotip geri ya da herhangi bir pozitif seçim sarf edilir ise, istenen değişikliği oluşturabilir. Burada, V. hızlı manipülasyon için bir yöntem mevcut cholerae kromozom (lar) ⁵ (Şekil 1). Bu TransFLP yöntem, V. gibi cins Vibrio bu organizmanın ⁶ ve diğer temsilci doğal yetkinlik yeni keşfedilen kitin-aracılı indüksiyon dayanmaktadır fischeri ^7. Doğal yetkinlik PCR tarafından oluşturulan DNA parçaları dahil olmak üzere ücretsiz DNA alımını sağlar. Bir kez alınır, DNA homolog bölgenin ⁸ sınırdaş 250-500 bp asgari varlığını verilen kromozomu ile yeniden birleştirilmesi kastedilmektedir. Bu komşu bölgeleri arasındaki bir seçim işaretleyici İçeren sık görülen transformantlar kolay algılanmasını sağlar. T "> Bu yöntem, V. cholerae, farklı genetik manipülasyonu için kullanılabilir ve potansiyel olarak da diğer doğal olarak yeterli bakteri olabilir. bizim daha önce yayınlanmış bir gen silme üzerinde çalışma ve ek olarak, bu yöntem tarafından gerçekleştirilebilir ne üç yeni örnekler sağlamak benzerlik etiketlenmesi sekansları ⁵ ek. kitin kaynaklı doğal dönüşüm ⁶ başlangıç protokolünü ilgili birçok iyileştirme adımlar bu TransFLP protokol içinde bu buluşa katılmıştır. Bunlar, diğerlerinin arasında ticari olarak mevcut kitin pul ^8, PCR tarafından yardım yengeç kabuk parçalarından replasman, madde ^9, ve FLP-rekombinasyon hedef sitesi (FRT) ⁵ transforme ilave olarak türetilmiş DNA. FRT sitesi FLP rekombinaz ¹⁰ tarafından aracılık seçim işaretleyicinin her bölge-yönlendirmeli eksizyon izin verir.

Protokol

TransFLP yöntem (Şekil 1) üç farklı yaklaşımlar ile örneklenmiştir: I), V nin ölümcüllüğünün belirleyicilerini kodlayan genin iki bitişik silme cholera (örneğin, ΔctxAB), II) bir patojenisite ada (örn., ΔVPI-1) çıkarılması ve III) T7 RNA polimeraz promotörü sekans bağlı olan entegre bir gen yukan-of-ilgi, daha sonra izin veren, ilgili gerginlik arka planda yapay ifadesi (örneğin, T7-tfoX) (Şekil 2).

1. Chitin Taneli hazırlanması

Standart bir 1.5 ml plastik tüp içinde kitin gevreği ağırlığı 50-80 mg. Bu, toplu olarak hazırlanabilir. Chitin pul Sigma (kat. numa....