Yöntem makalesi

Için basit Mikroakışkan Cihazlar

DOI:

10.3791/3780

⸱

30 Eylül 2012

 ,  , 
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Basit bir mikroakışkan cihaz anestezik ücretsiz gerçekleştirmek için geliştirilmiştir In vivo görüntüleme C. elegans, Intakt Drosophila Larva ve zebrafish larva. Cihaz, kalp ritmi, hücre bölünmesi ve hücre altı nöronal ulaşım gibi birçok süreçlerin zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için bu model organizmalar hareketsiz bir deforme PDMS membran kullanır. Biz bu cihazın kullanımını göstermek ve farklı model sistemlerinden toplanan verilerin farklı örnekler göstereceğiz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro fabrikasyon akışkan cihazları küçük organizmalar üzerinde in vivo çalışmalar için erişilebilir bir mikro-ortam sağlar. Basit üretim işlemlerinde yumuşak litografi teknikleri kullanarak 1-3 mikroakışkan cihazlar için kullanılabilir. Mikroakışkan cihazlar vivo lazer mikrocerrahi 2,6 ve hücresel görüntüleme 4,7 alt hücresel görüntüleme 4,5, için kullanılmaktadır. Vivo görüntüleme organizmaların immobilizasyon gerektirir. Bu emiş 5,8 kullanılarak elde edilmiştir, konik kanalların 6,7,9, deforme membranlar 2-4,10, ek soğutma 5, anestezik gaz 11, ısıya duyarlı jeller 12, siyanoakrilat yapıştırıcı 13 ve böyle levamizol 14 gibi anestezikler ile emiş , 15. Yaygın olarak kullanılan anestezik sinaptik iletim 16,17 etkilemek ve alt hücresel nöronal ulaştırma 4 üzerinde zararlı etkileri olduğu bilinmektedir. Bu study biz böyle Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larva ve zebrafish larva gibi bozulmamış genetik model organizmaların anestezik ücretsiz immobilizasyon sağlar poli-dimetil-siloksan (PDMS) aygıtı dayalı bir membran göstermektedir. Bu model organizmalar nedeniyle küçük çaplı ve optik olarak saydam veya yarı saydam cisimlerin mikroakışkan cihazlar in vivo çalışmalar için uygundur. Gövde çapları C. erken larva aşamaları için ~ 10 mikron dan ~ 800 mikron arasında değişir elegans ve zebrafish larva ve yüksek çözünürlüklü time-lapse görüntüleme için tam immobilizasyon elde etmek için farklı boyutlarda mikroakışkan cihazlar gerektirir. Bu organizmalar, bir sıvı sütunu ile sıkıştırılmış azot gazı tarafından uygulanan ve bir inverted mikroskop kullanarak görüntülü basıncı kullanılarak immobilize edilmiştir. Tuzak salınan Hayvanlar 10 dakika içinde normal hareket döner.

Biz C. time-lapse görüntüleme dört uygulamaları göstermek elegansyani nöronların görüntüleme mitokondriyal ulaşım, nakliye kusurlu mutant, glutamat reseptör ulaşım ve Q neuroblast hücre bölünmesinde presinaptik vezikül taşınması. Bu tür filmler elde edilen veriler mikroakış immobilizasyon anestezi uygulanmış hayvanlar (Şekil 3C ve 1J 4-F) göre, hücresel ve alt-hücresel olayların in vivo veriler elde yararlı bir araçtır ve kesin olduğunu göstermektedir.

Cihaz boyutları C. farklı aşamalarında time-lapse görüntüleme sağlamak için değiştirilmiş elegans, ilk evre Drosophila larva ve zebrafish larva. Duyusal nöronlarda GFP (syt.eGFP) ile etiketlendi synaptotagmin ile işaretlenmiş veziküllerin Ulaştırma bozulmadan ilk evre Drosophila larvaları kolinerjik duyusal nöronlarda eksprese sinaptik vezikül belirteçlerin yönlü hareketi gösterir. Benzer bir cihaz ~ 30 saat sonrası fertilizasyon (HPF) içinde kalp atışı time-lapse görüntüleme yürütmek için kullanılır olmuşturlarva zebrafish. Bu veriler, geliştirdiğimiz basit cihazlar vivo çeşitli hücre biyolojik ve gelişimsel fenomenleri araştırma modeli sistemleri çeşitli uygulanabilir olduğunu göstermektedir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. SU8 Usta Fabrikasyon

  1. Clewin yazılımını kullanarak mikroakışkan yapıları tasarlama ve devre filmi 8 mikron asgari özellik boyutu ile 65.024 DPI lazer plotter ile yazdırabilirsiniz.
  2. Akış tabakası ve ilgili kontrol katmanı için bir gofret her; 1 dk ve deiyonize su ile durulayın için% 20 KOH yerli oksit ile 2 cm X 2 cm lik silikon gofret temizleyin.
  3. Azot gazı ile parçaları kurulayın ve 4 saat boyunca 120 ° C'de sıcak bir plaka üzerinde kurutmak üfleyin. Parçaları bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyiniz.
  4. Sıra silikon parçaları eğiren mandren bir seferde bir ve vakum açın. ~ 20 ul heksametil-disilazane (HMDS) ve ceket onları kullanarak bir sn 30 sn için 3.000 rpm ardından 5 için 500 rpm'de SPIN150 spinner. Sahip silisyum yüzeylerde Kapak
  5. SU8-2025 ~ 1.5 ml (tamamen silikon gofret Kapak http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) ve 5 saniye boyunca 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak kat gofret 30 sn 2.000 rpm izledi. Bu, iplik protokol C larva erken aşamaları için kontrol ve akış tabakalar için uygun olan ~ 40 um kalınlıkta bir fotorezist üretir elegans.
  6. Spin ~ 5 için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak 1.5 ml SU8-2050 sn C. geç larva aşamaları için akış tabakası imalatı için uygundur ~ 80 mikron bir fotorezist kalınlık elde etmek için 30 sn 2.000 rpm izledi elegans, Drosophila / zebrafish larva ve bunlara karşılık gelen kontrol tabakaları için bazal akış katmanı.
  7. Üstüne SU8 kaplı tabakası ile sıcak plaka üzerinde silikon parçalarını yerleştirin. Yumuşak fırında 65 silikon kaplanmış parçalar ° C'de 10 dakika süreyle 95 ° C'de, ardından 1 dakika için. Parçaları bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyiniz.
  8. SU8-2025 kaplamalı sur ile pozlama sahnede yumuşak pişmiş silikon parçalarını yerleştirinUV lamba bakan üst yüzü. C. erken larva evreleri için sırasıyla akış katmanı ve kontrol katmanı desen tasarımı I (L1, Şekil 1B) ve tasarımı II (L2, Şekil 1B) ile fotoğraf maske kullanın elegans. SU8 tabakasının üstüne fotoğraf maske yerleştirin ve maske kaplamalı katmanı karşı düz olduğundan emin olun. UV lamba deklanşör açın ve 15 saniye boyunca fotoğraf maske ile 200 Watt UV lamba yumuşak pişmiş SU8 gofret maruz kalmaktadır.
  9. C. geç larva evreleri için akış katmanı ve kontrol katmanı üretmek için (adım 1.6 hazırlanmış) SU8-2050 kaplı parçalar üzerinde tasarımı I (L1, Şekil 1B) ve tasarımı II (L2, Şekil 1B) ile fotoğraf maske kullanın elegans. (I hazırlanan SU8-2050 ile kaplı gofret üzerine Drosophila / zebrafish larvalar için sırasıyla bazal akış katmanı ve kontrol katmanı için tasarım I (L1, Şekil 1C) ve tasarımı II (L2, Şekil 1C) ile fotoğraf maske kullanınn adım 1.6). 15 sn için 200 Watt UV lamba fotoğrafı maske aracılığıyla SU8 yüzeyleri açığa.
  10. Üstüne kaplı tabakası ile sıcak bir plaka üzerinde maruz silikon parçalarını yerleştirin. 10 dakika boyunca 95 ° C'de, ardından 1 dakika süreyle 65 ° C 'de fırında gofret nakledin. Parçaları bir sonraki adıma geçmeden önce soğumasını bekleyin.
  11. 20 dakika için SU8 geliştirici çözelti kullanılarak parçalar geliştirin. Izo-propil alkol (IPA) içinde parçalar durulayın ve kuru nitrojen gazı kullanılarak darbe.
  12. Üst SU8 desen ile bir desikatör içinde silikon parçalarını yerleştirin. Tricholoro 50 ul (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 2 saat için bir desikatör içinde silan buhar ile kaplayın adettir.

Önlemler: KOH tedavisi, fotorezist kaplama ve gelişmekte sırasında kimyasal çalışmalar için güvenlik önlemleri alın. Silan buhar kaplama bir havalandırılan bir desikatör içinde yapılmalıdır. Koru SU8 ışığa maruz yerinden direnirler. Bir UV lig ile koruyucu gözlük kullanınht kaynağı.

2. PDMS Kalıp İmalatı

  1. Plastik bir kap içinde sertleştirici 5 g Sylgard 184 taban 50 g birleştirilmesi ile 10:01 PDMS hazırlayın. ~ 3 dakika boyunca elle içeriği karıştırın. Karıştırma sırasında oluşan tüm hava kabarcıklarını çıkarmak üzere bir desikatör içinde Degas karışımı.
  2. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için yavaşça, kontrol katmanı için, tasarım II SU8 deseni ile silikon gofret üzerinde 5 mm kalınlığında PDMS karışımı dökün. Kabarcıklar halinde bütün kabarcıklarını çıkarmak için düşük vakum içinde SU8 model üzerinde, gazdan arındırmak PDMS dökme sırasında oluşur.
  3. Spinner mandrenin, akış katmanı için, tasarım I SU8-2025 modeli ile silikon gofret yerleştirin ve onları tutmak için vakum açın. ~ 1 PDMS karışımı ml ve kat 5 için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak gofret gofret örtün sn 30 sn için 1.500 rpm izledi.
  4. Coat ~ tasarımı I (L1, Şekil 1B) SU8-2050 model 80 mikron ile silikon gofret 1 ml PDMS karışımı içinC. geç larva aşamaları için akım katmanı 5 saniye için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak elegans 30 sn için 1.000 rpm izledi. Coat 35 sn için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak Drosophila / zebrafish larvalar için akış katmanlı tasarımı I (L1, Şekil 1C) SU8-2050 modeli ile silikon parçaları üzerinde PDMS karışımı kalın bir tabaka.
  5. Tasarım Bake PDMS kaplamalı silikon parçaları I ve kontrol katmanı için uygun tasarım II ile gofret C için PDMS içeren 50 bir sıcak hava konveksiyon fırında elegans ve / veya Drosophila / zebrafish larva ° 6 saat boyunca C.
  6. C. için SU8 desen II içeren silikon substrat PDMS parça kesip elegans ve / veya Drosophila / zebrafish larva keskin bir bıçak kullanarak. Harris bir zımba kullanarak PDMS kalıp içinde ana tutucu bağlantı rezervuar üzerinde ~ 1 mm çapında küçük bir delik.
  7. Delikli PDMS blok (kontrol için 40 mikron kalınlığında kalıp içeren yerleştirinyukarı bakacak şekilde kontrol tabakası ile kalıplanmış yan tepsi üstünde bir plastik tabaka L2). PDMS kaplı yüzeyi yukarı bakacak şekilde, aynı tepsiye 40 mikron kalınlığında SU8 tasarımı I içeren PDMS kaplı silikon gofret yerleştirin. Plazma temizleyici hücresinde tepsisini takın ve 2 dakika süreyle vakum açın. Daha sonra, plazma gücü açın ve odanın rengi açık pembe olana kadar odasının basıncını düşürebilir. 2 dakika için düşük vakum altında 18 Watt hava plazma için her iki yüzey Açığa.
  8. C. geç larva evreleri için kalın SU8 usta içeren deseni II 80 mikron kaldırılır yumrukladı PDMS blok yerleştir yukarı bakacak şekilde kontrol tabakası ile kalıplanmış yan tepsi üstünde bir plastik ya da elegans Drosophila / zebrafish larva. Daha sonra C. I 80 mikron kalınlığında tasarımı içeren silikon gofret üzerine kaplanmış gelen pişmiş PDMS katmanı sıkma yerleştirin elegans aşamalarında veya düz PDMS kaplı s ile aynı tepsiye aynı anda Drosophila / zebrafish larvaurface yukarı bakacak. Aynı protokolü kullanın plazma hava almaları için yukarıda.
  9. C. için iki plazma muameleye tabi olan yüzeylerde yerleştirin elegans ve / ya da birlikte hafif bir basınç ve 2 saat boyunca 50 ° C 'de bu sıcak hava konveksiyon fırını içinde fırında ile Drosophila / zebrafish larvası.
  10. C. için SU8 tasarımı ile silikon substrat gümrüklü cihazlar Kes elegans ve / veya Drosophila / zebrafish larva. Punch erişim akış kanal giriş ve çıkış depoları delikler.
  11. C. için bir plastik tepsi üzerinde gümrüklü PDMS kalıp yerleştirin yukarı bakacak akış katmanlı tasarım kalıp tarafı elegans. Temiz cam kapak kayma (22 X 22 mm, No 1 kalınlığı) ve aynı plastik tepsi üzerine yerleştirin. PDMS kalıp ve plazma odasının iç cam kapak kayma içeren kaseti takın. Alt cihazın PDMS yüzey ve cam kapak slipi ila 18 2 dk için düşük basınç altında Vat hava plazma Açığa. Gen ile iki plazma muameleye tabi olan yüzeylerde yerleştirinTLE basınç ve 2 saat boyunca 50 ° C 'de bu sıcak hava konveksiyon fırını içinde fırında.
  12. Ileride kullanmak üzere temiz bir ortamda cihazı saklayın.

3. Drosophila / Zebra balığı Cihaz için ek adımlar

  1. Temiz bir cam yüzey boyutu 2 cm tricholoro 50 ul ile x 2 cm (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 2 saat için bir desikatör içinde silan buhar. Açığa
  2. Spin ~ 35 sn için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak Silanlanmış cam yüzey üzerinde adım 2.1 'de hazırlanan 10:01 PDMS karışımı 1 ml. Yukarı bakacak kaplamalı yüzey 6 saat boyunca 50 ° C sıcaklıkta sıcak hava fırında PDMS kaplı cam yüzeyler pişirin. PDMS katmanı sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyiniz.
  3. Punch PDMS ayırıcı tabaka oluşturur, PDMS ortasında özel yapılmış bir keskin metal zımba kullanarak kaplı tabaka. Metal zımba şekli, Drosophila / zebrafish için akış tasarımı (L1, Şekil 1C benzer tasarlanmıştır ).
  4. PDMS ara katman ve düşük vakumlu plazma temizleyici kullanarak tek gümrüklü blok (Drosophila / zebrafish larvaları için adım 2.9 'da yapılan akışı katman ve kontrol katmanı), 18 Watt hava plazma maruz. Birlikte iki plazma muameleye tabi olan yüzeylerde yerleştirin ve 50 bir sıcak hava fırın ° C'de 2 saat boyunca bunları fırında.
  5. Cam gümrüklü cihaz kesin, giriş ve çıkış depoları ve adım 2.11 'da belirtildiği gibi bir plazma temizleyici kullanarak cam bir kapak kayma (22 X 22 mm, 1 Nolu kalınlık) tahvil ona yumruk erişim delikleri. Bu ~ 500 mikron bir kanal yüksekliği ile ilk evre Drosophila larvaları için bir immobilizasyon cihaz üretecek. Zebra balığı larvaları için, ek bir bağ adım PDMS ara katman üretim süreci çoğaltabilirsiniz. PDMS-S ikili tabaka 30 HFP zebrafish larvaları için 900 um arasında bir kanal yüksekliğini üretir.

Önlemler: Cihaz üretim sırasında toz parçacıkları kaçının. İki plazma yüzey temizliğilar uygun bağların için ücretsiz tamamen toz olması gerekir. Özel bir temiz oda cihazları içinde toz parçacıklarının birikimi en aza indirmek için uygun olmadığı durumlarda bir desikatör içinde cihazları saklayın.

4. PDMS membranı kullanılarak

  1. 18 gauge iğne (dış çap ~ 1,25 mm) sayesinde basınçlı azot gazı kaynağı regülatör ve ana tuzak rezervuar diğer ucunu bir mikro-flex boru (iç çapı ~ 1.6 mm, dış çapı ~ 4.8 mm) bir ucunu tüp yapıştırılmış. Boru bağlantısının orta kullanılan bir 3-yollu musluk zar üzerinde uygulama ya da basınç serbest bırakma sağlar.
  2. Bir C. ana tuzak rezervuar bağlamadan önce distile su ile 10 cm kolon PDMS cihaza bağlanmış boru Dolgu elegans ve / veya Drosophila / zebrafish larva cihaz.
  3. 14 psi ve okuma inci yönünde saptırma ana tuzak zar izlemek için azot tedarik vanayıbir inverted mikroskop düşük büyütmede e akış kanalı. Mikro-flex tüp içinde su kolonunun 3 yollu musluk açık olduğunda sıkıştırılır. Deflected membran kenarları iletilen ışık (Şekil 1I ve 1J) görülebilir. Membran saptırma PDMS membran altında toz parçacıkları / kabarcıklar değiştirme nedenleri ve kanal sınırları onları iter.
  4. Sıvı ön sıkışan hava olmadan tamamen mikrokanal doldurur kadar bekleyin.
  5. Onun dinlenme pozisyonu için zar rahatlamak için 3-yollu musluk kullanılarak basınç serbest bırakın.

5. C. takma elegans, Drosophila ve Zebra balığı Cihaz içine Larva ve Esnek PDMS Membran altında Onları Hareketsizleştirici

  1. M9 tampon ile akış kanalı doldurun [3 g KH 2 PO 4, 6 gr Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, 1 L H2O, aut ile sterilizeoclaving] C için elegans 18 ya da 1X PBS bir 10 dakika süreyle daha önce Drosophila / zebrafish larvaların 19 [8 g NaCl, 0.2 g KCI, 1.44 gr Na 2 HPO 4, 0.24 g KH 2 PO 4, H2O 1 L için, otoklav ile sterilize] deney.
  2. Tek bir C. bulun düşük bir büyütme stereo mikroskop kullanılarak NGM plaka 18 gerekli sahne elegans (veya agar yumurta plaka veya sıvı ortamda 20 elle dechorionated 30 hpf zebrafish larva ilk evre Drosophila larvaları). Bir mikro ucu içine tampon solüsyonunun küçük hacimli kullanarak tek bir hayvan seçin. Sonuna bir mikro ucu kullanın büyük Drosophila veya arabellekte zebrafish larva karşılamak için kesti.
  3. Akış kanalı giriş aracılığıyla tek bir organizma itin. Ana tuzak altında bireysel hayvan konumlandırmak için pipetleme basıncını ayarlayın.
  4. Yavaş yavaş kanal karşı hayvan konumlandırmak için PDMS membran basınç artışınel sınır ve C için 14 psi basınç ile hareketsiz elegans, Drosophila ve zebrafish larvaları için 3 psi 7 psi.
  5. Görüş mikroskobik alanının merkezinde immobilize hayvan yerleştirin. Yüksek çözünürlüklü parlak alan veya floresan görüntüleme için istenen ayarları bir inverted mikroskop kullanın. Önceden kare hızında tek veya time-lapse floresans görüntüler elde edin.
  6. Tuzak basıncı bırakın ve düşük büyütmede 5-10 dakika süreyle hayvan lokomosyon izlemek.
  7. Hayvan yıkayın ve yukarıdaki adımları tekrarlamanız taze hayvan yerleştirin.
  8. Bir şırınga kullanılarak uygulanabilir distile su kullanılarak atık rezervuar tüm hayvanlar yıkayın. Gelecekte yeniden kullanım için bir şırınga kullanarak hava basarak kanal kurulayın.

Önlemler: ana kanal içindeki akış yüksek pipetleme basınç gerektiren Hayvanlar tuzaktan yayımlanmasından sonra kötü lokomosyon / sağlık göstermek eğilimindedir ve ima için kaçınılmalıdırging. Kristaller tarafından kanalın tıkanmasını önlemek için tampon herhangi bir iz için akış kanalı temizleyin. Yağ, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılması durumunda, daha sonraki deneyler için gürültü oranı iyi bir sinyal vermeye devam edebilmek için cam kapak slipi temizleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir akış katmanda (Layer 1) ve bir kontrol katmanı (Katman 2) Şekil 1'de gösterildiği gibi: immobilizasyon cihazı bağ iki tabaka tarafından uydurulan bir bilayeri PDMS bloğudur. Ana tutucu bir regülatör ve bir sıvı kolonu (Şekil 1A) vasıtasıyla zar üzerine gerekli (3-14 psi) basınç uygulamak için bir 3-yollu kapama vanası yoluyla bir nitrojen gaz silindiri ile bağlanır. Deflected membran C. durağanlaştırır Farklı boyutları (Şekil 1B ve 1C) ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PDMS microfluidic cihazlar bu nedenle herhangi bir yarı saydam / şeffaf model organizma ve in vivo görüntüleme yüksek çözünürlük için kullanılan optik olarak transparan vardır. Bizim tasarım bozulmadan canlı hayvan hücresel ve alt hücresel olayların yüksek büyütme uzay-zamansal görüntüleme için uygundur. Yumuşak litografi teknikleri kullanarak Mikro ve model organizmaların çeşitli boyutlar için cihaz boyutları kolay manipülasyon sağlar. Çeşitli büyüklüklerde aygıtlar C. farklı aşamaları için üretilmişl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz C. için nuIs25 ve CGC için, bir Drosophila kafes korumak için Drosophila stok, Tarjani Agarwal Peter Juo Dr Krishanu Ray ederim elegans suşları. SPK Michael Nonet laboratuvarında jsIs609 yaptı. Biz mikroakışkan cihazlar jsIs609 hayvanların mitokondri ulaşım time-lapse görüntüleme onun yardım Arpan Agnihotri (BITS Pilani) teşekkür ederim. Biz zebrafish embriyolar bize sağlamak için Dr Vatsala Thirumalai ve Surya Prakash minnettarız. Biz Nanoteknoloji (No SR/55/NM-36-2005) Bilim ve Teknoloji-Merkezi Başkanlığı tarafından desteklenen dönen diske konfokal mikroskop kullanımı için NCB'ları Dr Krishna ve CIFF ederim. Biz de tartışmalar için Kaustubh Rau, V. Venkatraman ve Chetana Sachidanand ederim. Bu çalışma DBT doktora bursu (SM), DST fast-track düzeni (SM) ve bir DBT hibe (SPK) tarafından finanse edildi. SA SPK DST ve CSIR bağışları ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
Silikon gofret Üniversite gofret 150 mm (100) Makine Sınıf SSP Si
Clewin Yazılım WieWeb yazılım Sürüm 2.90
Lazer çizici Güzel Hat Görüntüleme 65024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 MICROCHEM SU8-2025, SU8-2050
Geliştirici MICROCHEM SU8 Geliştirici
Silan Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow Corning Sylgard 184
UV lamba Cumba 66943 200W Hg Oriel Işık
Sıcak hava fırını Ultra Aletleri Özel yapılmış 50 ° C 'de ayarlama
Sıcak plaka IKA Laboratuvar Cihazları 3810000 http://www.ika.com
Plazma temizleyici Harrick Plazma PDC-32G
Topaç Yarıiletken Üretim Sistemleri SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Cam kapak kayma Gold Seal 22 X 22 mm, No 1 kalınlığı
C. elegans Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P {chaGAL4} / CYO, UAS-syt.eGFP
Zebra balığı Hint vahşi tip Yabani tip
Tygon tüpü Sigma Z279803
Mikro iğne Sigma Z118044 1 cm parçalar halinde kesilmiş
3 yollu musluk Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Sıkıştırılmış nitrojen gazı Yerel Gaz tedarikçisi Basıncını kontrol etmek için bir düzenleyici kullanın
Stereo mikroskop Nikon SMZ645
Konfokal mikroskop Andor & Olympus Yokogawa dönen disk konfokal mikroskop
ImageJ Ulusal Sağlık Enstitüleri www.rsbweb.nih.gov / ij Java tabanlı görüntü işleme programı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  2. Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
  3. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
  4. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
  5. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
  6. Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
  7. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  8. Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
  9. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  10. Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
  12. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  13. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  14. Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
  15. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95, 905-928 (1980).
  16. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
  17. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  19. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  20. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
  21. Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
  22. Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
  23. Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
  24. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  25. Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
  26. Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
  27. Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200(2010).
  28. Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
  29. Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
  30. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
  31. Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
  32. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Yumu ak LitografiPDMS MembranDrosophila LarvalarZebrafish LarvalarAnesteziksiz SabitlemeAzot Gaz Bas ncZaman Atlamal G r nt leme

İlgili makaleler