Durduruldu-Akış Spektrofotometri kullanarak Flavin-Bağımlı monooksijenaz ve indirgeyici ve Oksidatif Yarı-Tepkime İzlenmesi

Summary

Bu indirgeyici ve oksidatif yarı-reaksiyonların her ikisi de araştırmak için bir durduruldu akış aletinin kullanımı açıklanmaktadır Aspergillus Siderofor A (SIDA), bir flavin bağımlı monooksijenaz. Daha sonra Sida ile reaksiyona türler tekabül spektrumları gösterir ve bunların kurulması için oran sabitleri hesaplamak.

Abstract

Aspergillus fumigatus siderofor A (SIDA) (örn. ferricrocin veya N ', N ", N'''-triacetylfusarinine C) ¹ ölümcüllük için gerekli olan hydroxamate siderofor biyosentezini in ornithine hidroksillenmesi katalize bir FAD içeren monooksijenaz olup. Sida tarafından katalizlenen reaksiyon indirgeyici ve oksidatif yarı-reaksiyonlar (Şema 1) ayrılabilir. yarı-tepkimesi indirgeyici, A f Sida bağlı okside ADÖ, NADPH ^2,3 oranında azaltılır. yarı-reaksiyonu oksidatif olarak , azaltılmış kofaktör ornitine bir oksijen atomu aktaran C4a-hydroperoxyflavin orta oluşturmak için moleküler oksijen ile reaksiyona girer. Burada oranları ölçmek ve yüklü bir durdu akış aracı kullanarak Sida farklı spektral formları algılamak için bir prosedür tarif anaerobik torpido. durdu akış aracı olarak, reaktanlarının küçük hacimleri hızla karışık, ve sonrası akım th tarafından durduruldue durdur şırınganın (Şekil 1), gözlem hücre yerleştirilen çözelti spektral değişiklikler zamanla kaydedilmektedir. Deneyin ilk bölümünde, biz NADPH tarafından bir f Sida içinde flavin anaerobik azalma doğrudan ölçülür tek modunda durdu akış aleti nasıl kullanabileceğinizi göstermek. Daha sonra bir f Sida ilk anaerobik yaşlanan bir döngü içinde zaman belirli bir süre için NADPH azalır çift karıştırma ayarları kullanın ve sonra gözlem hücresi (Şekil 1) moleküler oksijen ile reaksiyona. Sadece indirgeyici yarı reaksiyon takip olduğunda, çözümlerin herhangi bir oksijen indirgenmiş flavin kofaktör ile reaksiyona ve sonuçta okside flavin geri azalacağı a-C4a hydroperoxyflavin ara oluşturacak, çünkü bu deney gerçekleştirmek amacıyla, anaerobik tamponlar gereklidir . Enz tam cirosu olacağını çünkü bu kullanıcının doğru azalma oranları ölçmek için izin vermediYme. Yarı-reaksiyonu oksidatif çalışılan edildiğinde enzim azaltılması ve oksidasyon arasında, sadece adımları gözlenir böylece oksijen yokluğunda azaltılması gerekir. Bu deneyde kullanılan tampon, bir oksijen, oksijen ve daha yüksek konsantrasyonlarda yarı-reaksiyonu oksidatif çalışma böylece doymuş olduğunu. Bunlar genellikle flavin içeren monooksijenazları ile indirgeyici veya oksidatif yarı-reaksiyonlar ya çalışılırken yapılan işlemlerdir. Durdu akışı ile yapılan ön kararlı durum deneylerin zaman ölçeği intrinsik hız sabitlerinin belirlenmesi ve reaksiyon ⁴ ara algılama ve tanımlama izin saniye milisaniye vardır. Burada açıklanan prosedürler diğer flavin-bağımlı monooksijenazları uygulanabilir. ^5,6

Protocol

1. Anaerobik Tampon Hazırlanması

1. 100 mM potasyum fosfat tamponu, pH 7.5 1 L hazırlayın. Bir karıştırıcı çubuğa sahip bir 500 ml'lik şişe içine Büchner tamponun 250 mL dökülür.
2. Bir lastik tıpa ile şişesi Seal ve bir karıştırma plaka üzerine yerleştirin. Bir Schlenk hattına balonun kısa tüp bağlayın.
3. Ajitasyon ile oda sıcaklığında 5 saat boyunca vakum altında Degas tamponu. Bu süre boyunca, her saat gaz giderme ve argon püskürtülerek vakum 5 eliniz gerçekleştirin.
4. 10 saniye için argon ile şişesi yıkayın ve vakum manifoldu ayırın. Torpido gözü içine konur.
5. Kuvvetli çalkalama ile gece torpido gözünde şişesi açık bırakın.

2. Durduruldu-akış Sistemi Oksijen Çıkarma

1. 0.1 M sodyum asetat, pH 5.0 1 L hazırlayın. 250 ml Büchner balona bu tamponu 125 ml dökün ve adımları 1,2-1,4 gerçekleştirin.
2. 5 tarttınAspergillus Nijer (181.300 U / g) ve 0.9 g glukoz, 1.5 ml Eppendorf tüp ve 50 ml Falcon konik tüp kullanarak, sırasıyla gelen mg glukoz oksidaz. Torpido gözü içine hem kapları yerleştirin.
3. Anaerobik 0.1 M sodyum asetat, pH 5.0 (nihai 18,13 U / mL 'lik konsantrasyonu ve 100 mM, sırasıyla) 50 mL glukoz oksidaz ve glikoz eritilir. Bu çözelti (Şekil 1) ile rezervuar şırınga doldurun.
4. Sürücü vanalar "yük" konumunda olduğundan emin olun ve sürücü şırınga (Şekil 1) doldurun. "Sürücü" konumuna F vana çevirin. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek akım devresi aracılığıyla sürücü şırınga F tampon itin. Bu adımı toplam on kez tekrarlayın. Diğer üç sürücü şırınga ile aynı işlemi uygulayın. Bir saat bekleyin.
5. Aynı tampon contai ile rezervuar şırınga çözeltisi yeriniglukoz oksidaz ve glikoz ning. Adım 2.4 tekrarlayın.
6. Tekrar 2.5 adım ve çözüm gecede akış sistemi içinde bekletin.
7. Gecelik inkübasyondan sonra, tekrar 2.5 adım.

3. Oksijen Doymuş Tampon Hazırlanması

1. 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) hazırlanması ve bir karıştırma çubuğuna sahip bir 50-ml şişe içinde 50 mL dökülür. Bir Wheaton stoper ve bir Wheaton alüminyum mühür ile flakon kap.
2. Buz üzerinde şişe yerleştirin. Çözeltisine% 100 oksijen içeren bir tanka bağlı uzun bir iğne batırmak. Bir kanat olarak flakonun stoper üzerinden başka bir kısa iğne yerleştirin.
3. Ajitasyon ile 1 saat% 100 oksijen ile Kabarcık çözüm.
4. İlk tüpten kısa iğne kaldırmak ve uzun bir iğne çıkarmadan önce 10 saniye bekleyin. Torpido kapalı şişe yerleştirin.

4. NADPH Çözüm hazırlanması

1. 1.5 ml Eppendorf tüp NADPH 1 mg tartılarak i yerleştirintorpido gözü içine t.
2. Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponu, pH 7.5, 300 uL NADPH eritilir. Bir spektrofotometre (ε _{340 nm} = 6,270 M ^-1 cm ^-1) ile NADPH konsantrasyonunu belirlemek için torpido gözü bu çözüm 30 uL çıkarın.

5.. Enzim Çözüm gelen oksijen giderimi

1. Torpido gözünde dondurucu ve çözülme enzimini stok solüsyonundan 400 uL atın. Enzim stok solüsyonu (360 uM), daha önce 100 mM NaCl ihtiva eden 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) hazırlanmış ve sıvı azot içinde donduruldu.
2. Bir karıştırma çubuğu ile 25 ml şişeye enzim çözeltisi aktarın, bir Wheaton stoper ve bir Wheaton alüminyum mühür ile flakon kap ve torpido gözü kaldırmak.
3. Buz üzerinde şişe yerleştirin ve flakon stoper ile bir iğne sokarak bir Schlenk hattına bağlayın.
4. Degas 5 eliniz gerçekleştirerek enzim solüsyonu1 saat boyunca her 20 dakikada bir gaz alma ve argon püskürtülerek temizlenmelidir.
5. 10 saniye için argon ile flakon yıkayın ve vakum manifoldu ayırın. Torpido gözü içindeki buz üzerinde şişe yerleştirin.

6. Redüktif Half-tepki: İzleme Flavin Azaltma

1. Durdu akışı enstrüman ve üreticinin protokolü takip tek karıştırma modu için Pro-Data kontrol yazılımı hazırlayın.
2. Bir dolaşan su banyosunda (15 ° C) açın. 20 dakika için azot gazı ile yoluyla su oksijen çıkarın. Bu akış devresi yoluyla oksijen kirlenmesini önleyen.
3. Dolaşımdaki banyosuna durduruldu-akış su banyosu gövde bağlayarak sürücü şırınga sıcaklıkta ve 15 ° C gözlem hücre korur.
4. Pro-Data kontrol yazılımı seçin Photodiode Array, Dış tetik (durdu akışı işlemini aktif) ve Logarit ve Denetim Masası penceresindehmic ölçek.
5. Pro-Data görüntüleyici yazılımı başlatın ve veri dosyalarını saklanacağı dizini tanımlar.
6. Rezervuar şırınga C ve oksijensiz 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) ile F çözeltisi yerine geçer. "Sürücü" konumuna C ve F vanaları kapatın. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Manuel (ram her hareketinden önce Boş tıklayın) toplam ram beş kez ilgili sürücü yükselterek akım devresi boyunca her iki sürücü şırınga olan tampon itin.
7. Bu glukoz oksidaz akım devresi tamamen kaldırılmıştır sağlamak amacıyla, toplam 6.6 dört kez adım gerçekleştirin.
8. Pro-Data kontrol yazılımı bazal tıklayın.
9. Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponunda (15 uM durduruldu akışta karıştırıldıktan sonra nihai konsantrasyon) ile 1100 uL enzim stok solüsyonundan 100 ul karıştırılır.
10. Rezervuar syr çözümü değiştirinenzim solüsyonu ile birlikte inge F. "Sürücü" konumuna F vana çevirin. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek akım devresi aracılığıyla sürücü şırınga F enzim çözeltisi itin. Toplam üç kere uygulayın. Pro-Data kontrol yazılımı, 60 s edinimi süresi ayarlayın.
11. Her iki sürücü şırıngalar sürücü şırınga pistonları ile temasta bulunan bunlara karşılık gelen çözümleri ve sürücü koç ile dolu olduğundan emin olun. "Sürücü" konumuna hem vanaları açın ve sürücü gerçekleştirmek için Pro-Data kontrolü yazılımı Acquire tıklatın. Üç kopya olarak verileri elde etmek için iki kat daha fazla bu adımı yineleyin. Enzim okside formunda bu verimler spektrumları.
12. Sürücüleri elde A _{452 nm} değeri kullanılarak, (ε _{452 nm} = 13.700 M ^-1 cm ^-1) karıştırmadan önce enzim konsantrasyonunun belirlenmesi ve NADPH eriyik 4 mL hazırlanmasın 1,5 kat daha konsantre.
13. NADPH çözüm ve 6.10 açıklandığı gibi boş ve dolum durdurma şırınga üç kez rezervuar şırınga C çözümü değiştirin.
14. Adım 6.11 tekrarlayın. Enzim indirgeme sırasında bu verimler spektrumları.

7. Oksidatif Half-tepki: İzleme Flavin Oksidasyon

1. Durdu akışı enstrüman ve üreticinin protokolü takip çift karıştırma modu için Pro-Data kontrol yazılımı hazırlayın.
2. 6,2-6,5 adımları tekrarlayın.
3. Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) ile birlikte dört rezervuar şırınga içinde çözelti yerine geçer. "Sürücü" konumuna F vana çevirin. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek akım devresi aracılığıyla sürücü şırınga F tampon itin. Her sürücü şırınga ile toplam beş kez bu adımı gerçekleştirin.
4. Tot 7.3 dört kez adım gerçekleştirinarkadaşları, tamamen akış devresinden içeriğini çıkarmak için kullanılır.
5. Pro-Data kontrol yazılımı bazal tıklayın.
6. Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponunda (15 uM durduruldu akışta karıştırıldıktan sonra nihai konsantrasyon) ile 1000 uL enzim stok solüsyonundan 200 ul karıştırılır.
7. Bir enzim solüsyonu ile birlikte rezervuar şırınganın çözeltisi yerine geçer. "Sürücü" konumuna bir kapak kapatın. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek sürücü şırıngadan bir akım devresi aracılığıyla enzim çözeltisi itin. Bu adımı toplam üç kez uygulayın. Pro-Data kontrol yazılımı olarak, 0,5 s gecikme süresi ve 60 s edinimi süresi ayarlayın.
8. Tüm sürücü şırıngalar sürücü şırınga pistonları ile temasta bulunan bunlara karşılık gelen çözümleri ve sürücü koç ile dolu olduğundan emin olun. "Sürücü" konumuna tüm vanaları açın ve Pro-Dat in Acquire tıklayınsürücü gerçekleştirmek için bir kontrol yazılımı. Üç kopya olarak verileri elde etmek için bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Enzim okside formunda bu verimler spektrumları.
9. Şırınga A'da enzim solüsyonu "sürücü" pozisyonu ve boş ve dolum durdurma şırınga 7,7 açıklanan üç kez B vana açma 'den 1.5 kat daha konsantre bir NADPH çözümü ile rezervuar şırınga B çözümü değiştirin.
10. Oksijenli tamponu ile rezervuar şırınga C çözümü değiştirin. "Sürücü" pozisyonu ve boş ve dolum durdurma şırınga 7.7 açıklandığı gibi üç defa C vana çevirin. Pro-Data kontrol yazılımı olarak, sırasıyla 15 ve 900 s gecikme ve satın alma zamanını ayarlayın.
11. Adım 7.8 tekrarlayın. Tamamen indirgenmiş enzim reoxidation sırasında bu verimler spektrumları.

8. Veri Analizi

1. Pro-Data Converter yazılımı başlatın. Seçenekler simgesini tıklayın ve ProDataCSV Kaydet seçeneğini seçin.
2. Açıkveri dosyalarını dizinini muhafaza edildi. APL Pro-Data dönüştürücü penceresine dosyaları sürükleyin. Veriler aynı dizinde CSV formatında dosyalar otomatik olarak kaydedilecektir.
3. Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, ABD) ile CSV formatında dosyaları açın. 700 nm'de absorpsiyon karşılık gelen çıkarılarak durduruldu-akış izlerinin taban normalize.
4. Uygun üstel fonksiyonu için zamana karşı gelen maksimum absorbans arsa takarak KaleidaGraph (Sinerji Yazılım, Reading, PA) kullanılarak düzeltilebilir izlerini analiz edin. Şekil 2B, durdurulmuş-akış cihazı içinde enzim ve NADPH karıştırıldıktan sonra flavin redüksiyon oranını belirlemek üzere, zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmiştir 452 nm'de absorbans gösterilmiştir. Bu durumda, veri en uygun redüksiyon, res birinci ve ikinci faz için hesaplanmış bir çift üstel denklemi ve 0.65 ve 0.23 s ^-1 oranları kullanılarak elde edilmiştirolarak bulundu. C4a-hydroperoxyflavin ara ve oksijen ile indirgenmiş enzim reaksiyonu sonrasında reoxidation oluşum oranını belirlemek için, sırasıyla, 380 ve 452 nm, (Şekil 3B) olarak durdurulur-akış izleri analiz edilmiştir. Tek bir üstel denklemi kullanılarak, sırasıyla, yarı-reaksiyonu oksidatif birinci ve ikinci adımı için 1.4 ve 0,006 s ^-1 oranları hesaplandı.

9. Temsilcisi Sonuçlar

Önceki bölümlerde açıklandığı deneyler sonucu bir f Sida indirgeyici yarı-tepkimesi flavin indirgenmiş durumunu değişikliklere karşılık 452 nm de absorbans değişiklikler ölçülerek kontrol edilebilir göstermek. Bu adımın oranı uygun denklemi (; Adım 8,4 Şekil 2) 'ye uyan verileri tarafından tespit edilebilir. Elde edilen giderme oranı (0.65 ^s-1) ile hesaplanan k _kedi değeri benzerindirgeme reaksiyonu hızını-belirleyici adım olduğunu düşündürmektedir kararlı durum deneyler ^2,. Durduruldu-akış çift karıştırma modu yararlanarak, oksidasyon ve bu yarı-reaksiyonda aramaddelerinin oranı (; Adım 8,4 Şekil 3) tespit edilebilir. A f Sida tarafından katalizlenen reaksiyon olarak, C4a-hydroperoxyflavin açıkça (380 nm λ _max) algılanır ve oluşumu ve çürüme oranı hesaplanabilir. Elde edilen reoxidation (0,006 s ^-1) ile yavaş oranı C4a-hydroperoxyflavin yokluğunda ornitin çok kararlı olduğunu göstermektedir.

A f Sida şeması 1. Mekanizması. FAD kofaktör arasında isoallozaxine halkası gösterilmiştir. Okside flavin (A), NADPH (B) bağlanır ve azaltılmış flavin ve NADP ⁺ (C) oluşturmak üzere reaksiyona girer. Moleküler oksijen ve bağlayıcı ile reaksiyondan sonraornitin, C4a-hydroperoxyflavin (D) oluşur. Bu hydroxylating türdür. Ornitin hidroksillenmesi sonra, hydroxyflavin (E) okside enzim oluşturmak üzere susuz olmalıdır. NADP ⁺ katalitik döngüsü boyunca bağlı kalır ve (F) çıkacak son üründür.

Şekil 1. Durdu akış alet. A) Applied Photophysics SX20 bileşenlerinin Resim durduruldu-akış spektrofotometre. B numune işleme birimi) Resim. Çift karıştırma modunda akım devresi C) Programı.

Şekil 2. Durdu akış enstrüman NADPH ile Sida anaerobik azaltılması. 30 uM Sida ve 45 mM NADPH eşit hacimlerde karıştırıldıktan sonra kaydedilen A) Spektral değişir. İlk tayfı (SIDA okside) ve son tayfı (tam Sid azaltılmışA) mavi ve kırmızı sırasıyla vurgulanır. Zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedildi 452 nm'de B) absorbans iz.

Durdu akış enstrüman Sida Şekil 3. Oksidasyonu. A) tamamen indirgenmiş Sida ve oksijenli tampon karıştırma eşit hacimlerde sonra Spectral değişiklikleri kaydedildi. Nihai konsantrasyon 15 uM Sida, 22.5 mM NADPH, ve 0.95 mM oksijen edildi. Tayfı 0,034, 4,268 kaydedildi ve 727,494 s, sırasıyla, tamamen indirgenmiş enzim, C4a-hydroperoxyflavin ara madde (380 nm λ _max), ve oksitlenmiş enzim (450 nm λ _max) karşılık gelir. B) 382 ve 452 nm'de absorbans iz zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedildi.

Discussion

Redoks tepkimeleri katalizleyen enzimlere genellikle katalitik döngüsü sırasında önemli absorbans değişikliklere hem, normal şartlarda ve flavinler gibi kofaktörler içerir. Flavin ve okside formu ~ 360 ve 450 nm 'maxima sunar, ve onun azaltma genellikle 450 nm ⁷ absorbans azalması sonucu izlenir. Genel olarak, bazı geçici ara mevcut fakat düzenli spektrofotometrelerde ölçülecek formu ve çürüme çok hızlıdır. Applied Photophysics SX20 durduruldu-akış spektrofotometre (ya da benzer araç) kullanılarak, bu milisaniyelik zaman ölçeği içinde absorbans (ölü zaman, 2 ms) ölçmek için mümkündür. Burada bir model olarak hizmet veren, flavin bağımlı monooksijenaz A f Sida indirgeyici ve oksidatif yarı-tepkimeleri okudu. Hidrit transfer hızı anaerobik koşullar altında NADPH ile enzim karıştırıldıktan sonra 452 nm'de absorbans ile değişikliğinin ölçülmesi ile tespit edildi. Daha sonra, advantag alarakTam azalmanın elde edilene kadar durduruldu-akış aletinin çift karıştırma modunun e, enzim ilk ve sonra indirgenmiş enzim NADP ⁺ kompleksinin oksijen ile karıştırıldı, NADPH ile tepkimeye sokulmuştur. Bu prosedürü takiben, geçici oksijenli flavin ara algılamak ve oluşumu ve çürüme oranları ölçmek mümkündür. Bu ara maddelerin tanımlanması kataliz reaksiyona türlerinin doğası hakkında deneysel verileri sağlamaktadır. A f Sida, hydroxylating türdür C4a-hydroperoxyflavin (tipik olarak 370-380 nm'de izlenir), oluşumu durumunda. Buna ek olarak, her bir adımı sürekli oranında ölçen bir reaksiyon oranı-belirleyici adım hakkında bilgi elde etmek ve enzim kinetik ve kimyasal mekanizmaları aydınlatmak için yardımcı sağlar.

Genel olarak, benzer yöntemler proteinler gibi, diğer flavoenzymes veya meydana değiştirdiği absorbans için proteinleri için kullanılabileceğini devamain heme, piridoksal fosfat, veya non-heme demir ^8-10. Bu yöntemin bir sınırlandırma enzimi saflaştırılmış büyük miktarlarda gerekli olduğunu, ancak bu yüksek verimle bir ifade sistemi kullanılarak aşılabilir. Bir yeterince güçlü bir sinyal tespit edilebilmesi için yeterli protein kullanılarak kayıt spektrası için uygun protein konsantrasyonu tespit, ancak çok böylece enzim boşa değildir. Tipik olarak, durduruldu-akış Deneylerde kullanılan flavin içeren enzimleri için en düşük Enzim konsantrasyonu 6-10 uM (karıştırma sonrası) ve enzimin karşılık gelen molar sönüm katsayısı kullanarak saptanır. A f Sida söz konusu olduğunda, enzim bağlı FAD yüzdesi% 50-65 ^2'dir. Ciltli bir FAD kofaktör kataliz için gerekli olduğundan Apo-protein Bu deneylerde inaktif olarak kabul edilir. Bu yöntemin bir başka olası sınırlama bir enzim süreçlerini ortaya çıkarsa 2 daha hızlı ms (durdu-akış ölü zaman) bunlar görülemez, ancak there oranları bu sorunu aşmak için azaltılabilir stratejiler bildirilmiştir. Bunun bir örneği, bir ferrodoksin-NADP ⁺ redüktaz ¹¹ reaksiyon yüksek bir NaCl konsantrasyonu kullanılarak içerir. Durduruldu-akış akış devresinden oksijen ovma genellikle bu deneyde zor bir adım ve özel bir dikkat gereklidir. Etkin ve ucuz bir yöntemdir burada açıklandığı gibi glukoz oksidaz-glikoz sistemi en laboratuvarlarda başarıyla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, _{H2O 2} üretimini içeren ve bazı uygulamalar için protocatechuate dioksigenaz-protocatechuate sistemi gibi diğer alternatifi ¹² göz önüne alınmalıdır bazı sakıncaları vardır. Oksijensiz bir torpido gözü, kullanımı daha kolay anaerobik koşulları sağlamak için yapar, ancak şart değildir. Bu enzim oksijen yokluğunda azaltılabilir isteyen veya konsantrasyonda oksijen ile reaksiyona olarak oksijen durduruldu-akış akım devresi uzaklaştırılmalıdırbiz belirttiğiniz s. Durdu-akış torpido gözünde olmasına rağmen biz önceki deneylerde aerobik tamponlar kullanıldığı takdirde, oksijen akışı devrede var. Absorbans ölçümleri ek olarak, floresans ve sirküler dikroizm deneyleri karşılık gelen aksesuarlarla Applied Photophysics SX20 durduruldu-akış spektrofotometre içinde gerçekleştirilebilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Genel Laboratuvar Cihazları	Şirket	Katalog Numarası
Vakum pompası	Şartları yerine getirmemek	-
Büchner şişeler	Balıkçı	70340-500
Barlar Stir	Balıkçı	14-512-129
Plakalar Stir	Balıkçı	11-100-49S
Schlenk hatları	Kontes Cam	-
Argon tankı	Airgas	AR UPC300
Azot tankı	Airgas	NI200
Nitrojen tankı, ultra yüksek saflıkta notu	Airgas	NI UHP200
Oksijen deposu	Airgas	OX 40
5% Hidrojen dengesini azot tankı	Airgas	X02NI95B200H998
SX20 Stop-akış spektrofotometre	AppliedPhotophysics	-
Torpido gözü	Nazlı	-
Su banyosu	Brinkmann Lauda	-
Malzemeleri
50 mL BD Falcon tüpler	Balıkçı	14-432-23
15 mL BD Falcon konik tüpler	Balıkçı	05-527-90
1.5 mL Eppendorf mikrosantrifüj tüpler	Balıkçı	05-402-18
50 ve 25 mL cam şişe	Balıkçı	06-402
Kauçuk tıpalar	Balıkçı	06-447H
Alüminyum mühürler	Balıkçı	06-406-15
Reagents
Potasyum fosfat, monobazik	Balıkçı	AC2714080025
Potasyum fosfat, çift bazlı	Balıkçı	P288-500
Sodyum asetat	Sigma	S-2889
A. glukoz oksidaz Nijer	Sigma	G7141-250KU
D-Glikoz	Balıkçı	D16-500
β-NADPH	Balıkçı	ICN10116783
L (+)-Ornithine hidroklorür	Balıkçı	ICN10116783