Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

30.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/3894

⸱

21 Şubat 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Microbiology and Pathogenesis Activity, Bacterial Diseases Branch, Division of Vector-Borne Diseases, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, 2Tick-Borne Diseases Activity, Bacterial Diseases Branch, Division of Vector-Borne Diseases, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

Bu makalede

Özet

Keneler hemolimf, tükrük bezleri ve tükürük toplama patojenler hastalıklara nasıl neden kene kaynaklı incelemek önemlidir. Bu protokolü biz beslenmesini hemolimf ve tükrük bezleri toplamak nasıl gösterilmektedir Scapularis Ixodes Periler. Ayrıca kadın tükürük toplama göstermek I. scapularis Yetişkinler.

Özet

Keneler dünya çapında bulunur ve birçok kene kaynaklı hastalıklar insanlarda eziyet edilir. Keneler, Lyme hastalığı ve kene kaynaklı tekrarlayan ateş (Borrelia spp.), Rocky Mountain Benekli Ateşi (Rickettsia rickettsii), Ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis ve E. equi), anaplazmoz (Anaplasma phagocytophilum), ansefalit (kene neden patojenler için vektörleri kaynaklı ensefalit virüsü), babesiosis (Babesia spp.), Kolorado kene ateşi (Coltivirus) ve tularemi (Francisella tularensis) 1-8. Düzgün konak içine aktarılacak bu enfeksiyon ajanları farklı şekilde, gen ekspresyonu düzenleyen kene proteinleri ile etkileşim ve kene 3,9-13 yoluyla göç ederler. Örneğin, Lyme hastalığı ajanı, Borrelia burgdorferi, kenenin enzootik döngüsü 14,15 şölen ve kıtlık aşamalarına farklı gen ifade aracılığıyla uyarlar. Dahası, bir Ixodes kene gibi bir tüketirbloodmeal Borrelia çoğaltmak ve ortabağırsak gelen onlar tükürük bezlerinin seyahat ve sınırdışı tükürük 9,16-19 ile ev sahibi içine iletilir hemocoel, göç.

Kene beslenirken ev sahibi genellikle güçlü bir hemostatik ve immün yanıtı 11,13,20-22 ile yanıt verir. Bu konak yanıtları rağmen, I. kene tükürük 3,11,20,21,23 besleyen kene yardım immünomodülatör olan proteinlerin parçalayıcı ajanlar, antikoagülanlar ve fibrinolysins içerdiğinden scapularis birkaç gün süreyle besleyebilir. Kene tükürük veya tükürük bezi ekstraktı (SGE) tarafından sahip immünomodülatör faaliyetleri çok sayıda kene kaynaklı patojenlerin 3,20,24-27 iletimi, çoğalması ve yayılması kolaylaştırmak. Daha da kenelerin beslenme aktif incelemek ve kene tükürük toplamak esastır enfeksiyöz ajanlar hastalığı nasıl neden kene kaynaklı anlamak için. Bu video protokol için diseksiyon teknikleri gösteriyorhemolimf toplanması ve aktif I. beslenmesini tükürük bezlerinin çıkarılması scapularis periler 48 sonra ve 72 saat sonrası fare yerleşimi. Ayrıca yetişkin bir dişi I. tükürük toplama göstermek scapularis kene.

Protokol

1. Slayt hazırlanması için hemolimf toplama

(Film 1)

  1. Yavaşça yüzeyi sterilize ila 10 dakika süreyle% 70 etanol içinde daha sonra 5 dakika boyunca% 3 topikal hidrojen peroksit ve bir hayvan yerden aktif besleme kenelerin kaldırmak ve.
  2. Pap kalem silan kaplı mikroskop lamı üzerine bir daire çizin ve pap kalem daire içinde kene yerleştirin ile.
    1. Silan kaplı slaytlar mikroskop lamı için hemolimf en iyi yapışması için kullanılır.
  3. Bir mikroskop (1X objektif, 10X mercek, 3.5x büyütme) altında kene görüntüle.
  4. Yavaşça kene bacaklarının yayılmak ve kene immobilize etmek için forseps ile kenenin sırtı aşağı bastırın.

Not: Bu ortabağırsak veya ponksiyon kene bozabilir ve hemolimf kontamine olabilir, çünkü kene immobilizing çok sert basmayın zaman.

  1. Th kenenin bacak veya bacakları organınıtek neşter ince bir nokta ile e distal eklem. Enfektivite belirlemek için hemolimf üzerinden sadece 1 bacağı ampute edilmesi gerekir. Slaytta hemolimf toplanması için birkaç bacakları ampute olabilir.

Not: Bu hemolimf bir ortabağırsak kontaminasyona neden olabilir, çünkü vücudun çok yakın bacak kesmeyin.

  1. Bacak veya bacakları kesildikten sonra yavaşça slayt üzerine bacaklar dışarı salgılaması için hemolimf için kenenin sırtından basınç uygulamaya devam edeceklerdir. Yavaşça hemolimf yaymak için slayt etrafında kene taşıyın.

2. Tükürük bezinin çıkarılması

(Movies 2 & 3)

  1. Fosfat Nokta birkaç 25 ul havuzları bir mikroskop lamı üzerine (PBS) tamponlanmış ve PBS havuzlarından birine tick koyun.
  2. Bir mikroskop (1X objektif, 10X mercek, 3.5x büyütme) altında kene görüntüle.
  3. Ince uçlu forsepsle ile kene stabilizetemelinde capitulum (ağızdan parçalar) veya kene arka tutarak s.
  4. Kene arka içine ince uçlu pens takın ve kene organları açığa sırtı var kadar dilim. İsterseniz ortabağırsak şu anda kaldırılmış ve bir mikroskop lamı üzerine PBS taze bir havuz veya PBS içeren bir mikrofuge'de tüpüne aktarılabilir.
  5. Bilateral kene bacakları yanında bulunan tükürük bezlerinde (üzüm salkımı benzeri) çifti bulun. Tükrük bezleri kene enkaz tükürük bezlerinin bozulması ve kaybını azaltmak için PBS taze bir havuz, hala tükürük bezleri içeren, ana kene kısmı hareket arasında görünmüyorsa.

Not: Daha önce bir beslenme içinde, tükrük bezleri daha sonra beslenme üzerine karşılaştırıldığında onlar gibi gelişmiş olmadığından bulmak zordur.

  1. Ince uçlu pens ve PBS taze bir havuz yer olan kene ile tükürük bezleri çıkarın.
  2. Wiince inci forseps herhangi bir dış mikroorganizmalar ve kene enkaz kaldırmak için bu yıkama adımı 3-4 defa daha tekrarlayın, başka bir temiz 25 ul PBS havuzuna tükürük bezlerinde transfer uçlu.

Not: Bireysel tükürük bezlerinin kaybı ve kesintileri azaltmak için hafifçe tükürük bezi kümeleri yıkayın.

  1. Bir silan kaplı slaytta PBS temiz bir havuza veya PBS içeren bir mikrofuge'de tüp bezleri yerleştirin.

3. Tükürük toplama

(Movie 4)

  1. Yavaşça tavşan veya tam tıkalı onlar düşüyorlar hemen önce ince uçlu pens, yaklaşık 5-7 gün post-eki kullanarak başka bilgisayardan yetişkin dişi kene kaldırın.
  2. Seloteyip ile bir mikroskop lamı bir ucuna yaklaşık tıkanık kene uyun. Bant yaklaşık konulmalıdır ¾ baş doğru kenenin sırtı kadar yolu, kenenin temelinde capitulum (ağız parçaları) maruz bırakarak.
  3. Bandı% 5 pilokarpin çözeltisi kenelerin dorsal yüzeyini pipet 5 ul (metanol içinde) ön kenarının birleştiği yerde. Bant pilokarpin kenenin temelinde capitulum ile temas etmesine izin vermeden, kenenin sırtı pilokarpin fitil izin verin.
  4. Mikroskop lamı üzerine toksik olmayan modelleme kil parçasının kenenin ağız yaklaşık bir inç monte edin.
  5. Ince uçlu pens istenilen çapa çekti kılcal tüp 28 ucunu kırın kullanılması.
  6. Bir mikroskop altında kenenin temelini capitulum görüntüle.
  7. Yavaşça maksiller palps kılcal boru dışına ikamet için izin çekti kapiler tüpe kenenin hypostome uyacak.
  8. Kılcal tüp yerinde tutmak için kil modelleme içine kılcal tüpün ucunu basın.
  9. Yüksek nem (örneğin, ıslak pap ile kaplı bir strafor kapaklı kutusu ile karanlık bir odası içinde monte salyalar kene yerleştirin er havlu). Yerçekimi tükürük toplama yardımcı sağlayan hypostome noktaları böylece, kabın dibine kayar eğim.
  10. Oda sıcaklığında bir kap yerleştirin.
  11. Yakından ilk saat için salyalar keneler izlemek ve bir Pasteur pipeti ampul kılcal tüpler dışarı atarak oluşturulan, tükürükteki toplamak. İlk saat sonra, en az 4 saat süreyle birikimi her saat kontrol edin. Oluşturulduğunda gibi tükürük toplamak için devam edin.

Not: Yeterince tükürük yapılmaktadır Araştırma için toplanan bir kez Tükürük toplama durdurulabilir.

  1. Keneler salyalar değildir veya daha fazla tükürük gerekiyorsa, salivasyon bazen hypostome masaj kılcal tüpü kullanılarak oluşturulan olabilirsem.
  2. Ihtiyaç kadar -80 ° C de tükürük ve mağaza proteaz inhibitörü kokteyl 0.1 hacimleri ekleyin.

4. Temsilcisi Sonuçlar

e_content "> Film 1 kısmen beslenen I. scapularis perisi tutun ve bir mikroskop lamı üzerine hemolimf toplamak için bacaklarını kesmek zorunda gösterilmiştir. bacak veya bacakları açık bir sıvı (Şekil 1A ve 1B) salgılanır ampute edildikten sonra. Eğer ortabağırsak hemolimf olduğu gibi bulanık görünüyorsa ampute bacak (lar) (Şekil 1C ve 1D) çıkan delinmiş veya yırtılmış.

Perisi 48 veya 72 saat beslenme sonra tükürük bezlerinin çıkarılması filmleri 2 ve 3'te gösterilmiştir. Kene enkaz bir sürü genellikle yoktur delinirse sonra (trakea, Malpighi tüpleri tübüller, kan oluşan bağ dokusu vb) tükürük bezlerinin kaybı veya bozulmasını önlemek için, PBS taze bir havuz kene taşıyın. Perisi kesmişler sonra tükürük bezleri bulunur Şekil 2A ve 2B gösterisi ve şekil 2C PBS bir havuzda tükürük bezi başlıkların çıkarılması gösterir.

Tükürük toplama I. den kurmak scapularis yetişkin kadın i s film 4 ve Şekil 3'te gösterilmiştir. Bir tüp içine salyalar bir kene film 5 gözlenmektedir. Salivasyon teşvik etmek ve yetişkin dişi kene başına tükürük 20 ul fazla verim alınabilir pilokarpin kullanılan tükürük toplama yöntemi.

figure-protocol-1
Şekil 1. Bir I. scapularis nympha Etiketli yapılar.

Film 1. Ixodes scapularis hemolimf koleksiyon. film izlemek için tıklayınız .

figure-protocol-2
Şekil 2. Kirlenmemiş (A & B) ve perisi bacağını gelen yayan (C & D) hemolimf kontamine.

48 saatlik bir beslenen I. Film 2. Tükürük bezi çıkarma scapularis perisi.pload/3894/3894movie2.avi "> film izlemek için tıklayınız.

72 saat beslenen I. Film 3. Tükürük bezi çıkarma scapularis perisi. film izlemek için tıklayınız .

figure-protocol-3
Şekil 3. Ixodes scapularis perisi tükrük bezleri. (A & B) önce çıkarılması için bir 72 saat beslenmiş perisi olarak tükürük bezlerinin örnekleri. (C) tükürük bezi küme kaldırıldı.

Film 4. Tükürük toplama bir yetişkin I. den kurmak scapularis dişi kene. film izlemek için tıklayınız .

figure-protocol-4
Yetişkin I. gelen Şekil 4. Tükürük toplama scapularis kadın ticks. (A & B) kil modelleme tarafından tutulan kapiler tüpün unpulled sonu ile kılcal boru çekti sonunda onun hypostome bir slayt monte işaretleyin. (C & D) salyalar yetişkin I. içeren Nemlendirilmiş odası scapularis dişi keneler.

Film 5. Bir tüp içine salyalar scapularis dişi kene Ixodes. film izlemek için tıklayınız .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kene hemolimf, tükrük bezleri ve tükürük toplama kene kaynaklı patojen bulaşma çalışmada önemlidir, yaygınlık, yaygınlaştırma, proliferasyon ve kene ve ana 6,11-13,20,23,29 hem de kalıcılık. Bir kene 30,31 incelemek için çeşitli yollar vardır. Ancak, tükrük bezleri alırken düzgün böylece tükürük bezlerinin yırtılması veya kenenin kalıntıların kayıp değildir kene incelemek için önemlidir. Tükürük bezleri onlar ortabağırsak kontaminasyonu gidermek için ve sonra tükürük bezi ekstraktı (SGE) elde etmek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar vektör kaynaklı hastalıkların Hayvan Kaynakları Şubesi Bölümü teşekkür etmek istiyorum, özellikle Andrea Peterson, Lisa Massoudi, Elçin O'Brien ve fare ve tavşan bakımı ve bakım için John Liddell. Biz de bu yazının doğru katkıları için Amy Ullmann, Theresa Russell, ve Barbara J. Johnson teşekkür etmek istiyorum. Son olarak, bu yazının filme ile ilgili tüm legalities yönlendirmek için grafik çizimler ve Judy Lavelle üretmek için CDC, İletişim için Associate Direktörü Office Alissa Eckert kabul etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Şirket Katalog Numarası
Hidrojen peroksit Balıkçı H312-500
Etanol Acros 61509-5000
PBS Boston Bioproducts BM-2205
Dumont Güzel forseps (3C) Balıkçı NC9906085
Silan tedavi mikroskop Bioworld 42763007-1
Pap kalem Bioworld 21750008-1
Süper don artı mikroskop Balıkçı 12-550-18
Pilokarpin Sigma P6503-5G
Proteaz inhibitörü kokteyl Sigma P2714
# 11 bistüri atılabilir Tüy 2975 # 11
Zehirli kil modelleme Fisher S17307
Kapiler tüpler Chase bilimsel Cam, inc 40A502

Kaynaklar

  1. Quach, K. A., Boctor, F. N., Elston, D. M. What's eating you? Hyalomma ticks. Cutis. 87, 165-167 (2011).
  2. Graham, J., Stockley, K., Goldman, R. D. Tick-borne illnesses: a CME update. Pediatr. Emerg. Care. 27, 141-147 (2011).
  3. Nuttall, P. A., Paesen, G. C., Lawrie, C. H., Wang, H. Vector-host interactions in disease transmission. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2, 381-386 (2000).
  4. Estrada-Pena, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Exp. Appl. Acarol. 23, 685-715 (1999).
  5. Nuttall, P. A. Pathogen-tick-host interactions: Borrelia burgdorferi and TBE virus. Zentralbl Bakteriol. 289, 492-505 (1999).
  6. Jones, L. D., Hodgson, E., Nuttall, P. A. Enhancement of virus transmission by tick salivary glands. J. Gen. Virol. 70, 1895-1898 (1989).
  7. Labuda, M., Nuttall, P. A. Tick-borne viruses. Parasitol. 129, 221-245 (2004).
  8. Socolovschi, C., Mediannikov, O., Raoult, D., Parola, P. Update on tick-borne bacterial diseases in Europe. Parasite. 16, 259-273 (2009).
  9. Zhang, L., et al. Molecular Interactions that Enable Movement of the Lyme Disease Agent from the Tick Gut into the Hemolymph. PLoS Pathog. 7, e1002079(2011).
  10. Piesman, J., Schneider, B. S. Dynamic changes in Lyme disease spirochetes during transmission by nymphal ticks. Exp. Appl. Acarol. 28, 141-145 (2002).
  11. Brossard, M., Wikel, S. K. Tick immunobiology. Parasitol. , Suppl 129. S161-S176 (2004).
  12. Machackova, M., Obornik, M., Kopecky, J. Effect of salivary gland extract from Ixodes ricinus ticks on the proliferation of Borrelia burgdorferi sensu stricto in vivo. Folia Parasitol. 53, 153-158 (2006).
  13. Nuttall, P. A., Labuda, M. Tick-host interactions: saliva-activated transmission. Parasitol. 129, 177-189 (2004).
  14. Anguita, J., Hedrick, M. N., Fikrig, E. Adaptation of Borrelia burgdorferi in the tick and the mammalian host. FEMS Microbiol. Rev. 27, 493-504 (2003).
  15. Hovius, J. W., van Dam, A. P., Fikrig, E. Tick-host-pathogen interactions in Lyme borreliosis. Trends Parasitol. 23, 434-438 (2007).
  16. Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal Clin. Invest. 119, 3652-3665 (2009).
  17. Ribeiro, J. M., Mather, T. N., Piesman, J., Spielman, A. Dissemination and salivary delivery of Lyme disease spirochetes in vector ticks (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 24, 201-205 (1987).
  18. Piesman, J. Transmission of Lyme disease spirochetes (Borrelia burgdorferi. Exp. Appl. Acarol. 7, 71-80 (1989).
  19. De Silva, A. M., Fikrig, E. Growth and migration of Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks during blood feeding. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 397-404 (1995).
  20. Horka, H., Cerna-Kyckova, K., Skallova, A., Kopecky, J. Tick saliva affects both proliferation and distribution of Borrelia burgdorferi spirochetes in mouse organs and increases transmission of spirochetes to ticks. Int. J. Med. Microbiol. 299, 373-380 (2009).
  21. Brossard, M., Wikel, S. K. Immunology of interactions between ticks and hosts. Med. Vet. Entomol. 11, 270-276 (1997).
  22. Wikel, S. K. Tick modulation of host immunity: an important factor in pathogen transmission. Int. J. Parasitol. 29 (99), 851-859 (1999).
  23. Binnington, K. C., Kemp, D. H. Role of tick salivary glands in feeding and disease transmission. Adv. Parasitol. 18, 315-339 (1980).
  24. Guo, X., et al. Inhibition of neutrophil function by two tick salivary proteins. Infect. Immun. 77, 2320-2329 (2009).
  25. Montgomery, R. R., Lusitani, D., De Boisfleury Chevance, A., Malawista, S. E. Tick saliva reduces adherence and area of human neutrophils. Infect. Immun. 72, 2989-2994 (2004).
  26. Lima, C. M., et al. Differential infectivity of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi derived from Ixodes scapularis salivary glands and midgut. J. Med. Entomol. 42, 506-510 (2005).
  27. Severinova, J., et al. Co-inoculation of Borrelia afzelii with tick salivary gland extract influences distribution of immunocompetent cells in the skin and lymph nodes of mice. Folia Microbiol. 50, 457-463 (2005).
  28. How to pull capillary tubes [Internet]. , benchflydotcom. Available from: http://www.youtube.com/watch?v=2yKHvKCatmM (2009).
  29. Labuda, M., Jones, L. D., Williams, T., Nuttall, P. A. Enhancement of tick-borne encephalitis virus transmission by tick salivary gland extracts. Med. Vet. Entomol. 7, 193-196 (1993).
  30. Kariu, T., Coleman, A. S., Anderson, J. F., Pal, U. Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut. J. Vis. Exp. (48), e2544(2011).
  31. Edwards, K. T., Goddard, J., Varela-Stokes, A. S. Examination of the internal morphology of the Ixodid tick Amblyomma maculatum koch, (Acari:Ixodidae); a "How-to" pictorial dissection guide. Midsouth Entomologist. 2, 28-39 (2009).
  32. Ledin, K. E., et al. Borreliacidal activity of saliva of the tick Amblyomma americanum. Med. Vet. Entomol. 19, 90-95 (2005).
  33. Ribeiro, J. M., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva? Med. Vet. Entomol. 18, 20-24 (2004).
  34. Barker, R. W., Burris, E., Sauer, J. R., Hair, J. A. Composition of tick oral secretions obtained by three different collection methods. J. Med. Entomol. 10, 198-201 (1973).
  35. Burgdorfer, W. Hemolymph test. A technique for detection of rickettsiae in ticks. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 1010-1014 (1970).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Tükürük Bezi DiseksiyonuTükürük ToplamaKene DiseksiyonuFosfat Tamponlu SalinPilokarpine StimülasyonuKapiler Tüpİmmünofloresan AnalizKonfokal Mikroskopi
Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.