Cinsel haçlar ve rekombinant döl izolasyonu, ipliksi mantar için önemli araştırma araçlarıdır Fusarium graminearum, Gerekli teknikleri başarıyla bu süreçlerin sunulmaktadır yürütmek.
Yöntem makalesi
Cinsel Gelişim ve askopor Deşarj Fusarium graminearum
Bu makalede
Özet
Özet
Fusarium graminearum filamentöz mantarların gelişmesi ve patojenite çalışmaları için bir model sistem haline gelmiştir. F. graminearum'un en kolay havuç agar, perithecia adlandırılan meyve organları, üretir. Perithecia perithecium gelişim aşamasında üretilen belirli sayıda doku grupları, içerirler. Bunlar, (sırasına göre) perithecium baş (ascogenous hifler ortaya çıkmasına neden olan), dış cidar, paraphyses (asci geliştirmek kadar perithecium merkezi işgal steril Miseller), asci ve ascospores oluşumunu içeren asci 14 içinde. Bu dokuların her birinin gelişimi yaklaşık 24 saat ile ayrılır ve cinsel gelişimi sırasında 12,8 transkriptomik çalışmalara göre olmuştur. Her aşamanın fotoğrafları da dahil olmak üzere gelişme daha ayrıntılı bir açıklama için, Hallen ve ark. (2007) bakın. Burada, senkron üretim ve hasat için yöntemler sunmakly gen düzenlenmesi, geliştirilmesi ve fizyolojik süreçlerin zamansal çalışmaları için perithecia arasında çimler gelişmekte. Bu yöntemler F. ile kullanılmak için özel olarak yazılmış rağmen graminearum, meyva verme teknikleri kültüründe uyarılan edilebilir olması koşuluyla, diğer mantarlara çeşitli için kullanılır ve gelişme için bazı senkronize vardır edilebilir. Biz son zamanlarda F. cinsel gelişimi incelemek için bu protokolü adapte olması verticillioides. Perithecia gelişen bir çim uyarılabilir çünkü bireysel perithecia, bu türün ele alınmak zorunda olsa da, süreç geliştirme (Sikhakolli ve Trail, yayınlanmamış) çalışmak için iyi çalıştı.
Mantar meyve organlarının en önemli fonksiyonu sporların yayılmasını olduğunu. Ascomycota (TSKB mantar üreten) türlerin çoğunda, sporlar yoluyla (ve epiplasmic sıvı) sporların ejeksiyon sürüş, TSKB içinde turgor basıncı nesil nedeniyle, TSKB gelen çekilirTSKB ucu 2,7 gözenek. Zorla askopor deşarj çalışmalarımız bu süreçte mutasyonların taranması için kullanabileceğiniz bir "spor deşarj assay", geliştirilmesi sonuçlandı. Burada Bu testin ayrıntıları sunulmaktadır.
F. graminearum homothallic, ve böylece, uyumlu bir ortak yokluğunda meyve gövdeleri oluşturabilirler. Homothallism bir avantajı, bu geçiş, belli bir özelliği, bu tür 14,7 cinsel gelişme çalışma kolaylaştırmıştır bir yönü için yavru homozigot üretmek için gerekli değildir. Bununla birlikte, heterothallic suşları 5,9 geçiş için kullanılabileceği oluşturulan edilmiştir. Bu, bir suş 1 birkaç genleri için mutantları elde etmek homothallic suşları çapraz da mümkündür. Bu, 2 suşları ile bir Petri tabağına coinoculating yapılır. Buluşma noktası boyunca perithecia çoğunluğu (ana türlerden biri bir mutasyon sağlanan inhibe etmez rekombinant olacak) döllenmedir. Perithecia yaşına gelince, onlar zorla boşaltarak onların yerine ascospores topluca terlemek. Çıkan spor eksuda (a cirrhus denir) perithecium ucunda oturur ve kolayca bireysel sporların kurtarma için kaldırılabilir. Burada rekombinant perithecia ve rekombinant ahfadının kurtarma kimlik kolaylaştırmak için bir protokol mevcut.
Protokol
1. Perithecia Üreten
- F. verimli bir suşu ile 6.0 cm çaplı Petri kabındaki Merkezi inokülasyon havuç agar 10 graminearum'un (PH-1 Tavsiye).
- Yeri oda sıcaklığında (18-24 ° C) parlak floresan ışıkları altında yemekler aşılanmış ve misel Petri (3-5 gün) dış kenarına ulaşana kadar büyümeye olanak sağlar. Ticari ev floresan ışıkları meyve vücutta oluşumu ve akıntı teşvik için sorunsuz çalışır.
- Yavaşça steril bir kürdan ile havadan miselyumla kaldırın.
- Steril bir cam hockeystick veya steril bir cam çubuğun yuvarlak ucu ile yüzeye 1.0 ml% 2.5 Tween 60 aq dağıtın.
- Işığa plakalar dönün. Plakalara parafilm katmayın.
- 24 saat sonra, plaka yüzeyi parlak bir görünüme sahip olmalıdır. Eğer miselyumla belirirse, kazıma yüzey ve yeniden başvuru Tween-60 çözüm.
- Önümüzdeki hafta içinde perithecia gelişimi dikkate alınmalıdır. Bir ara aşamalarınperithecium geliştirme hafifçe RNA ekstraksiyonu (Şekil 1) dondurulmuş agar ve flaş yüzeyini kazıyarak hasat edilebilir.
- Olgun sporlar Gün 7 ile plaka kapağında birikecektir. Başlangıçta bu sadece bir mikroskop altında görülebilir, ancak çıplak gözle olacak şekilde günde 9, onlar yeterli yoğunluğu birikmiş olacaktır.
2. Askopor Deşarj Tahlili
- 6. günde Tween çözüm uygulandıktan sonra, bir odun kurdu olan agar 1 cm çap daire kesip. Alternatif olarak, bir bisturi aynı büyüklükte bir bölümü kaldırmak için kullanılabilir. Daire yarısında dilimlenmiş ve her yarım bardak mikroskop lamı üzerine yerleştirilebilir.
- Orient adet meyve gövdeleri içeren yüzey sürgünün yüzeyine dik olacak şekilde, ve sporların sürgünün uzunluğu aşağı ateşlenir.
- Işıklar altında gece bir nem odasında slayt yerleştirin. Sporlar üzerinde birikecektirslayt ve çıplak gözle ertesi sabah (Şekil 2) görülebilir.
- Biriken sporların su ile yıkanmış ve kapama istenirse belirtilebilir.
- Potansiyel askopor deşarj inhibitörleri testin montaj sırasında agar bloğunun arkasına ekleyerek test edilebilir. Deşarj azaltmak bazı inhibitörleri daha önceden iyon kanalı bu teknik 15 ile test edilmiştir.
3. Rekombinant Döl üretimi
- F. iki suşları ile havuç agar aşılayarak çapraz Initiate graminearum (bir Nit + ve bir NIT-), Petri tabağı zıt tarafları üzerinde inokulasyon noktaları yerleştirilmesi.
- Bir kez hif yüzey doldurdu, hava bölümünü kazıyarak ve yukarıda açıklandığı gibi Tween-60 çözümü uygulayın. Hif karşılamak Petri tarafında dikkat edilmesi gereken bir işareti kullanın.
- Işık kültürler dönün ve perithecia geliştirdik kadar inkübe ve cirrhi olmak varsilahı iki kültür arasındaki kesişme boyunca perithecia gelen oluşturur.
- Iki kültürün kesiştiği boyunca perithecia görüntülemek içine mikroskop altında getirmek. Bir böceğin iğne ucu ile, steril ve steril suya batırılmış, iğne ucuyla hafifçe Bu sınır boyunca bir cirrhus dokunun. Pin üzerindeki nem cirrhus pin ayrılmamak için izin vermelidir.
- Sporlar yıkayın bir Eppendorf tüp içinde 200 ul steril su içinde üzerinde cirrhus ile pin ucu durulayın.
- Alev pimi tekrar ıslatın ve başka bir cirrhus seçin. 10-15 cirrhi çekme, ve su ile ayrı bir tüp içinde, her yerleştirin.
- Kısaca vorteks tüpler cirrhi askıya içermesin.
- 9 cm Petri kabındaki MMTS orta 1 bir pipet ve yer ile spor süspansiyon 60 ul çıkarın. Steril bir hokey sopası ile yayıldı. Geriye kalan spor süspansiyonu bir hafta için 4 ° C'de saklandı ve gerekirse kaplandı edilebilir.
- Inkübasyon3-5 gün oda sıcaklığında (gerekli değil ışık) az te çok küçük koloniler (Şekil 3) ortaya çıkıncaya kadar. Koloniler arasında fenotipleri iki tür olacak. Nit-koloniler Nit + koloniler daha sparser hif olacaktır. Rekombinant perithecia gelen Cirrhi yaklaşık olarak eşit oranda her iki koloni fenotipleri gösterecektir. Üzerlerinde tek bir fenotip koloniler ile plakaları atılır. Bazen ikiden fazla fenotip diğer faktörlere bağlı olarak segregasyon neden olduğunu not edin.
- V8 veya depolama için havuç agar kolonileri taşıyın. Doğru fenotipi onaylamak için; Czapek Kullanıcı Dox Agar (nit suşlar Czapek Kullanıcı Dox üzerinde büyümek olmaz) ve Klorat (Nit + suşlar Klorat ile PDA üzerinde büyümek olmaz 0,5 M Potasyum Klorat) ile PDA Testi koloniler. İstenilen niteliklere için bu kolonilerin inceleyin.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Perithecia Üreten
Amaç bir çim sahip olmaktırHerhangi bir misel veya belirgin sporlar olmadan perithecia. Kültür yüzey siyah kadife (Şekil 1) benzer bir görünümde olacaktır. 24 saat at Tween uygulandıktan sonra ağar yüzeyine hafif bir parlaklık sahip olmalıdır. Miseller yeniden takdirde, bord perithecium gelişimi indüklemek için yeteri kadar sıyrılmıştır edilmemiş olabilir.
Askopor deşarj
Her zaman yabani tip suşu sizin test agar birkaç blok sağlar. Bu ateş yoksa, sonra ya perithecia çok genç veya çok yaşlı. Onlar çok eski ise, o çok sayıda hif bir beyaz renk veren kültür yüzey üzerinde görünür. Bu durumda değilse, çok genç olabilir ve deney 24 saat içinde tekrar denenmelidir. Bazen, kültürler de deşarj yoktur ve deneyi tekrarladı gerekecektir. Eğer uygun ışık koşullarında test gerçekleştirmek emin olun.
Rekombinant döl
Rekombinant perithecia iki suş arasındaki kesişme boyunca perithecia çoğunluğu kadar yapmak gerekir. Genellikle bir çapraz den 10 cirrhi işlemek ve bunlardan en az bir rekombinant 4-6 olmalıdır. Çok nadiren, bir mutasyon çiftleşme bir gerginlik engeller. Ebeveynlerden biri Aberan büyüme fenotipi varsa, en fazla 2 fenotipleri MMTS üzerinde koloniler arasında mevcut olabilir.
Şekil 1. Havuç agar perithecium gelişim aşamaları. Tween uygulamadan sonra Sol, 72 saat. Kırmızı pigment ve yüzeyde siyah taneleri gibi görünen çok genç perithecia unutmayın. Sağ, 144 saatte, olgun perithecia oluşturmuşlardır. Her iki kültürde de yüzeysel misel ve tama yakın olmadığına dikkat edin.
Şekil 2. Deşarj testi. Turuncu havuç agar tapa odaklı böylece tha olduğunuzorla yüzeyinde olgun perithecia boşaltılan t sporların cam sürgünün yüzeyinde birikebilir. 15 saat birikimi zaman.
Şekil 3. Nit + ve seçici MMTS ortamda nit-koloniler arasında büyüme farklar. Nit-koloniler (ok başları) daha küçüktür. Nit + koloniler (oklar) güçlü büyüme göstermektedir. Fotoğraf 7 gün sonra alınır.
Tartışma
F. graminearum özellikle iyi açıklamalı genomunun (kullanılabilirliği nedeniyle meyve vücut geliştirme çalışması uyarlanmıştır mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / ; 4), ve kullanılabilirliğini Affymetrix- mikroarray 6 dayanır. Bu askopor deşarj 7,11,3 için önemli genlerin tanımlanması için yeteneği kolaylaştırmıştır. Burada sunulan yöntemler araştırmacı F. meyve organlarının genetik analiz için gelişim evreleri ve fonksiyonları ayrı bir set odaklanma sağlayacak graminearum'un. Yöntemleri de kültüre meyve uyarılan edilebilir ilgili mantarlar kolayca adapte olan ve diğer mantar meyve vücut tiplerinde in geliştirilmesi için bir standart olarak kullanılabilir.
Bir spor ateş fenotipi değerlendirmek için yeteneği sporlar görmek için küçük ve zor türler gibi ince olabilir F. graminearum'un. Temiz bir slayt üzerinde sporların toplanması sporları slayt kapalı yıkanabilir ve nicelendirildi edilebileceği gibi, görsel değerlendirme ve niceliksel hem de kolaylaştırır. Bazı mantar türleri kendi spor ve spor durulanır edilemez çevreleyen bir zamk üretmek, ancak slayt üzerinde kalması mikroskobik sayılmalıdır. Biz Sclerotiniasclerotiorum gerçek olmak için bu bulduk.
Açıklamalar
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (FT için MCB-0.923.794) bir hibe ile desteklenmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | |
| Fusarium graminearum suşu PH-1 | Mantar Genetik Stok Merkezi, Kansas | FGSC 9075 | |
| Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 | |
| Czapek en Dox Agar | Difco, Becton Dickinson | 233810 | |
| Potasyum Klorat | Sigma-Aldrich | 255572 |
Kaynaklar
- Bowden, R. L., Leslie, J. F. Sexual recombination in Gibberella zeae. Phytopathology. 89, 182-188 (1999).
- Buller, A. H. R. Researches on Fungi. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).
- Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).
- Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization. Science. 317, 1400-1402 (2007).
- Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).
- Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta. Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).
- Hallen, H., Trail, F. The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).
- Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins. Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).
- Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae. Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi. Genetics. 118, 417-423 (1988).
- Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).
- Qi, W., Kwon, C., Trail, F. Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).
- Trail, F. Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota. FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).
- Trail, F., Common, R. Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study. Mycologia. 92, 130-138 (2000).
- Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum. Mycologica. 94, 181-189 (2002).
Yeniden basım ve izinler
