Cam yünü filtreler dünyada araştırma gruplarının bir dizi su bazlı virüsler kullanılır konsantre edilmiştir. Burada cam yünü filtreleri oluşturmak için basit bir yaklaşım göstermek ve filtreleri de su kaynaklı viral, bakteriyel ve parazitik patojenlerde konsantre etkilidir göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Konsantre Su Bazlı Virüsler ve Tarım Zoonotik Patojenler için Cam Yünü Filtreler
Bu makalede
Özet
Özet
Şüpheli kontamine su patojen seviyelerini değerlendirmek için önemli bir ilk adım yoğunlaşmasıdır. Konsantrasyon yöntemleri örneğin, örnekleme programını birden fazla patojen grubunu hedef ise birden çok yöntem gereklidir anlamına gelir Giardia ve Cryptosporidium 1, ABD Çevre Koruma Ajansı Yöntem 1623 belirli bir patojen grubu için özel olma eğilimindedir. Mevcut yöntem diğer bir dezavantajı, ekipman, örneğin, virüsler 2 yoğunlaştırmak için 1MDS kartuş filtre ile VIRADEL yöntemi komplike ve pahalı olabilir. Bu yazıda su kaynaklı patojenler yoğunlaştırmak için cam yünü filtreler oluşturmak için nasıl açıklar. Filtre elüsyon sonra, konsantre kültürel veya moleküler yöntemlerle patojen tespiti ve sayımı takip gibi santrifüj gibi ikinci bir konsantrasyon adım, için uygundur. Filtreleri çeşitli avantajları var. İnşaat kolaydır ve filtreler ile inşa edilebilirözel örnekleme gereksinimlerini karşılamak için ny boyutu. Filtre parça mümkün ciddi bir proje bütçe etkilemeden örnekleri, çok sayıda toplamak için yapım ucuzdur. Büyük örnek hacimleri (100s 1,000 L) örnek bulanıklık gelen tıkanma oranına bağlı olarak konsantre edilebilir. Filtreleri son derece taşınabilir ve böyle bir pompa ve akış metre gibi az ekipman ile, onlar bitmiş içme suyu, yüzey suyu, yeraltı suyu ve tarımsal yüzey akış örnekleme alanında uygulanabilir. Son olarak, cam yünü filtrasyon sadece tek bir yöntem gerekli olduğu şekilde patojen çeşitli tiplerde konsantre için etkilidir. Burada su bazlı insan entero, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum, ve kuş gribi virüsü konsantre filtre etkinliği üzerine rapor.
Protokol
1. Cam Yünü hazırlanması
- Filtreleri her bir parti öncesi ve yaptıktan sonra,% 10 çamaşır suyu çözeltisi ile çalışma alanı sterilize edin.
- Eldiven ve önlük giyin. En azından 20 dakika süreyle 121 ° C ile 15 psi ile otoklavda bir kova sterilize. Steril kova cam yünü yerleştirin.
- Ters osmoz su ile cam yünü Doymuş ve 15 dakika ıslatın.
- Kovadan ters osmoz su boşaltın.
- 1 M HCl ile cam yünü Doymuş ve 15 dakika ıslatın.
- Kovadan 1 M HCl boşaltın.
- Ters osmoz su ile cam yünü durulayın.
- Iyice karıştırın.
- PH kağıdı ile pH kontrol edilir ve nötr pH elde edilinceye kadar ters osmoz su durulama tekrarlayın.
- Durulama suyu dökün.
- 1 M NaOH ile cam yünü Doymuş ve 15 dakika ıslatın.
- Kovadan 1 M NaOH boşaltın.
- Rnötr pH elde edilinceye kadar ters osmoz durulayın EPEAT.
- Durulama suyu dökün.
- Bunun yerine bir kova, bir cam yünü yıkama tasarımında cam bir pipet yıkama (Şekil 1) benzer olan, inşa edilebilir.
- Steril Fosfat ile tamamen kapsayacak cam yünü salin (PBS) pH 6.8 ayarlandı Tamponlu.
- 4 de hazırlanmış cam hemen yün veya mağaza kullanın ° C Bu iki haftaya kadar saklanabilir. Kullanmadan önce, zaman içinde artacak gibi pH nötr olduğundan emin olun. PH nötr değilse, steril fosfat ile yeniden durulama (pH 6.8) Tamponlu Salin.
2. Cam Yünü Filtre Montaj
- Erkek adaptörü naylon parçaları kapaklar vidalanan böylece PVC kapaklar ve musluk konuları içine 11/16 inç delik delin. Bu aşama, sadece birinci asamblenin için gereklidir. Bundan sonra, kapaklar yıl için kullanılabilir. Teflon Uygulanaylon parçaları konuları ve kapakları için vida bandı.
- Cam yünü küçük parçalar ile PVC boru paketleyin. Sıkı paketi, bir araba motoru vanası gibi, metal bir piston kullanın. Ambalaj büyük kuvvet gerektirmez. Sıkı yeterli cam yünü yerde kalır böylece paketleyin ve kanalları oluşturmazlar. Ancak, öyle sıkı su filtresi aracılığıyla akamaz paketi yok. Uygun şekilde paketlenmiş zaman, dakika başına 4 ila 5 litre debisi filtre 40-60 psi arasında basınçları ile su muslukları takılı olduğunda ulaşılabilir olmalıdır. Bu protokolde belirtilen PVC boru boyutu için, yaklaşık 85 gram yıkanmış ve paketlenmiş cam yünü boru başına kullanılır. Dara boru kütlesi 85 gram yıkanmış cam yünü ile en iyi yükleme dengesi ve paketi üzerindeki boş bir PVC boru artırır kadar.
- Bağlı erkek adaptörü naylon parçaları ile PVC kapaklar içine polipropilen yerleştirin.
- PVC boru dişli kısımlarına teflon bant uygulayın.
- PVC p PVC kapaklar üzerine vidalayınIPE ve etiket bir filtre ucu giriş ve diğer ucunu çıkış. Bu, elüsyon aşaması için daha önemlidir. Hangi sonu girişi önemli değil etiketlenmiştir.
- Steril Fosfat 60 ml bir kateter kullanarak filtre içine (pH = 6.8) Tamponlu Salin itin şırınga uçlu. Aşırı karşı uç çıkacaktır.
- Wrap sızıntı önlemek için parafilm sıkıca biter. Filtreler 4 ° C de 30 gün kadar saklanabilir
3. Örnekleme
- 0.525% NaClO (yani, standart çamaşır suyu% 10 solüsyonu) 30 dakika öğeleri recirculating veya daldırarak örnekleme için kullanılan boru sterilize edin. Hipoklorit çözeltisi akıtılarak bu takip ve ters-osmoz bir litre su ile% 2'lik bir stok susuz sodyum tiyosülfat çözeltisi ilave edilerek 25 mL yapılan% 0.05 sodyum tiyosülfat ile nötralize.
- 7.5 'den daha büyük bir pH değerine sahip örneği su için, HCI ile 6.5 ila 7.0 pH ayarlanır. HCl konsantrasyonu uzanabilir 0.251 M. Dört litre M 0,5 M HCl genellikle suyun ortam pH ve tamponlama kapasitesine bağlı olarak iki adet 800 litrelik örnekleri için yeterlidir. Bir peristaltik pompa veya Venturi (Şekil 2) kullanılarak örnekleme sırasında HCl enjekte edilir. Pompa hızını veya hedef pH ulaşmak için Venturi açılış ayarlayın. Bir alan pH metre kullanılarak örnek hattı çıkışında pH ölçün.
- Cam yünü filtresi takunya eğer yüksek bulanıklık su ile bir ön filtreyi kullanın. (Ön filtreyi ve konut Özellikler Malzeme listesinde online olarak bulunmaktadır.) Patojenler de (bkz. aşağıda) cam yünü filtresi ile birlikte akıtılan gereken ön filtre tarafından yakalanan parçacıkları eklenebilir çünkü.
- 2 ila 4 litre / dakika akış hızı ayarlayın. Tipik örnek hacmi 200 ile 1.500 litre vardır.
- 48 saat için 4 ° C'de bir plastik steril bir torbaya cam yünü ve filtre deposu çıkarın.
4. Elüsyon
- Eke dayalı bir halkaya cam yünü filtresiÖrnek girişi sonunda bir polipropilen şişeye aşağı bakacak şekilde duruyor. Örnek akış yönüne ters elüt edilmesi.
- Filtre içine 9.5 pH değerine sahip 0.05 M glisin steril% 3 sığır eti ekstraktı 80 ml itin.
- 15 dakika bekleyin.
- Filtre içine 9.5 pH değerine sahip 0.05 M glisin steril% 3 sığır eti ekstraktı başka 80 ml itin.
- Köpük Filtre girişinden dışarı çıkana kadar hava iyice filtresi itin.
- 1 M HCl ile 7.0 arasında ve 7.5 ile arındırıldı pH ayarlama.
- Mağaza 4 at eluat ° C daha uzun süreler için 24 saate kadar veya -20 ° C'de.
- Biri kullanıldığında Ön filtreyi Zehir. Sökün konut merminin ve steril eldivenli elleriyle yerde ön filtre tutarak konut içinde kalan tüm suyu dökün.
- Konut kartuştan Ön filtreyi çıkarın ve 15 "x 6" zip-lock çanta içine kayma.
- 0,05 M g steril% 3 sığır ekstresinin 200 mL dökülürBir torbaya 9.5 pH ve zip-lock ile güvenli bir şekilde mühür ile lycine.
- Tüm yüzeyi sığır özü ile temas sağlamak için ön filtresi paketlenmiş birkaç kez invert.
- 15 dakika bekleyin bazen ters ve torbalı ön filtreyi masaj.
- Zip-kilidi açın. Ön filtreyi etrafında tutuş torba sıkıca mümkün olduğunca fazla sığır eti ekstraktı gibi sıkmak ve steril eldivenli elleriyle Ön filtreyi çekin.
- Bir polipropilen şişeye sığır eti ekstraktı eluat dökün.
- 1M HCI ile 7.0 arasında ve 7.5 ile arındırıldı pH ayarlama.
- Mağaza 4 at eluat ° C daha uzun süreler için 24 saate kadar veya -20 ° C'de. Ön filtresi eluat ayrı patojenler için analiz veya cam yünü filtre eluat ile kombine edilebilir.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
| Patojen | Su Seviyesi Bulanıklık (NTU) bir | Miktarı Tohumlu / L b, c, d | % Kurtarma ± 1 SS | Sayı Bağımsız Denemeler |
| Enterovirus-Poliovirüs Sabin III | 0.5 | 500 | % 81 ± 11 | 7 |
| Enterovirüs Poliovirüs Sabin III | 0.5 | 5000 | % 67 ± 12 | 8 |
| Enterovirus-Poliovirüs Sabin III | 215 | 500 | % 59 ± 32 | 7 |
| Enterovirus-Poliovirüs Sabin III | 215 | 5000 | % 38 ± 22 | 6 |
| Enterovirus-Poliovirüs Sabin III | 447 | 500 | % 56 ± 18 | 8 |
| Enterovirus-Poliovirüs Sabin III | 447 | 5000 | % 63 ± 37 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 0.5 | 5 | % 38 ± 14 | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 0.5 | 50 | 53 ±% 19 | 8 |
| Ağlamakptosporidium parvum | 215 | 5 | % 40 ± 16 | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 215 | 50 | % 30 ± 6 | 6 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 5 | % 33 ± 13 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 50 | % 28 ± 11 | 8 |
| Salmonella enterica | 0.5 | 5 | % 29 ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica | 0.5 | 500 | % 56 ± 16 | 8 |
| Salmonella enterica | 215 | 5 | % 32 ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica | 215 | 500 | % 34 ± 11 | 6 |
| Salmonella enterica | 447 | 5 | % 34 ± 18 | 8 |
| Salmonella enterica | 447 | 500 | % 31 ± 24 | 8 |
- Nefelometrik Bulanıklık Ünitesi
- Genomik kopya / L olarak qPCR tarafından numaralandırılan Enteroviruslar
- C. parvum ookistleri olarak immünofloresan tarafından numaralandırılan
- S. enterica koloni oluşturan birimler olarak kültür tarafından numaralandırılan
Değişen su bulanık ve patojen yoğunlukları ile Tablo 1. Cam yünü konsantrasyonu.
| Patojen | Su Numune Yer | Tutar Tohumlu / L | % Reco çok |
| Kuş Gribi H5N2 | Sundi Gölü, Anchorage Borough | 2500 | % 42.9 |
| Kuş Gribi H5N2 | Minto Flats, Fairbanks Kuzey Yıldızı Borough | 2500 | % 36.7 |
| Kuş Gribi H5N2 | Portage Vadisi, Anchorage Borough | 2500 | % 7.8 |
| Kuş Gribi H5N2 | Potter Marsh, Anchorage Borough | 2500 | % 41.5 |
| Kuş Gribi H5N2 | Willow Lake, Yukon-Koyukuk Borough | 2500 | % 15.5 |
- Genomik kopya / L olarak qPCR göre ölçülmüş
Avian influenza virüsünün Tablo 2. Cam yünü konsantrasyonu Alaska beş siteleri su kullanarak.
les/ftp_upload/3930/3930fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "/>
Şekil 1. Cam yünü yıkama diyagramı. Bu durulama zaman tasarrufu, bunun yerine bir kovanın kullanılabilir. Kavramı bir cam pipet yıkama benzer.
Peristaltik pompa ile asit enjeksiyonu ile Şekil 2. Cam yünü filtrasyon. Pompa hortumunu su musluğu ve cam yünü filtre arasında örnek hattı içine asit tanıtır "T" konnektör unutmayın. örneklenmiş suyu pH> 7.5 sahipse pH ayarlaması gerekli değildir.
Cam yünü filtreler bulanıklık seviyeleri ve patojen yoğunluklarda (Tablo 1), geniş bir aralık ile su patojenler konsantre etkili olmaktadır. Bunu test etmek için, dechlorinated musluk suyu 20 litre sudaki bulanıklığın istenilen seviyeye ulaşmak için kurutulmuş silt tınlı toprak (0, 1.27 veya 2.75 g / L) ile karıştırılır ve daha sonra çeşitli yoğunluklarda patojenler ekildi. Subir cam yünü filtreden geçirildi, eluat içinde konsantre patojenler numaralandırılan, ve bu değer, yüzde geri kazanım hesaplamada pay idi. , Yüzde geri kazanım hesaplama payda olan su, içine ekilmiş patojenlerin miktarı daha sonra birinci patojenler numaralandırma negatif eluat içine patojenler tohumlama ile tespit edildi. Negatif eluat bir filtre aracılığıyla bir dereceye giremeyen 20 litrelik Örnek geçirerek ve elüt kullanılarak hazırlandı. Olumsuz bir eluat içinde ekilmiş patojenler sayısallaştırabilmek cam yünü filtre tarafından oluşturulan matris farklılıklar meydana gelebilir patojen numaralandırma farklılıklar önler. QPCR tarafından patojenler miktarının Bu adımın önemi Lambertini ark olarak tartışılmıştır. 3. Bir 20 litre negatif kontrol örneği yüzde kurtarma hesaplama yanıltabilecek verebilecek hiçbir yerli patojenler bugünkü vardı belirlemek için cam yünü filtrasyon ile konsantre edildi. A 10 mikron nominal gözenek boyutu ön filtresinin wbulanıklık seviyesi ≥ 215 NTU iken olarak kullanılır.
Poliovirüs Lambertini ve diğerleri tarafından tarif. 3 ikincil konsantrasyonu ve nükleik asit ekstraksiyon prosedürleri ve primerler ve prob kullanılarak gerçek zamanlı qPCR ile ölçüldü. Cryptosporidium parvum poliovirus için ikincil konsantrasyonu prosedüre göre hazırlandı nihai konsantre örnek hacmi (FCSV) içinde ölçüldü . Ookistleri immünfloresan (MeriFluor Cryptosporidium ve Giardia Algılama Takımı, Meridian Hayat Bilgisi, Inc, Cincinnati, OH) tarafından görüntülenmiştir. Salmonella enterica XLD agara plaklamayla FCSV içinde sayılabilir (Remel, Lenexa, KS) ve sayma koloni oluşturan- birimler.
Cam yünü filtreleri kuş gribi virüsleri (Tablo 2) konsantre etkilidir. Düşük patojenite kuş gribi virüsü (H5N2) Alaska çeşitli yerlere su içine ekilmiş ve abov açıklandığı gibi yüzde kurtarma hesaplandıe. İkincil konsantrasyonu ve nükleik asit prosedürler poliovirus gibi gerçekleştirildi; virüsü Spackman ve diğerleri tarafından tarif primerler ve prob kullanılarak qPCR ile ölçüldü 4.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Cam yünü filtreleri gibi bitmiş içme suyu 7, yeraltı 8,9, yüzey suyu 10, deniz suyu 11, atıksu 12 olarak su kaynaklarının çeşitli insan Enterik virüsler konsantre birçok araştırma ekipleri 3,5,6 tarafından kullanılan ve edilmiştir tarım akış 13. Burada filtreler de kuş gribi virüsü gibi bakteriyel ve parazitik patojenlerde sırasıyla Salmonella enterica (serovar Typhimurium) ve Cryptosporidium parvum, konsantre etkilidir rapor....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkarlarının çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Biz Video anlatan William T. Eckert teşekkür ederim. Cam yünü protokolün geliştirilmesi US EPA YILDIZ Grant R831630 tarafından finanse Enterik Riskler (WAHTER Study) için Wisconsin Su ve Sağlık Deneme parçasıydı. Alaska örnekleri USGS mali desteği ile A. Reeves, A. Ramey ve B. Meixell toplanmıştır. Ticaret, ürün veya firma adları her türlü kullanımı açıklayıcı amaçlıdır ve ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif veya öğenin adı | Şirket | Katalog numarası | |
| Hidroklorik asit | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Sodyum hidroksit | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Fosfat Tamponlu Salin Sodyum klorür Potasyum fosfat dibazik Potasyum fosfat monobazik | Fisher Scientific Fisher Scientific Fisher Scientific | BP358-212 BP363-500 BP362-500 | |
| Sodyum hipoklorit yani çamaşır suyu | Clorox Co | ||
| Sodyum tiyosülfat, susuz | Fisher Scientific | S 475-212 | |
| Sığır özü, kurutulmuş | Becton, Dickinson and Company | 211520 | |
| Glisin | Fisher Scientific | G46-500 | |
| Yağlı sodocalcic cam yünü Veya R-11 unfaced fiberglas izolasyon | Isover ref = "http://www.jm.com" target = "_blank"> Johns Manville | Bourre 725 QN | |
| Polipropilen mesh | Netleştirme Endüstriyel | xN4510 | |
| 2 "x4" Sch 80 PVC dişli boru nipel | Grainger | 6MW35 | |
| 2 "Sch 40 PVC kap | Grainger | 5WDW3 | |
| Erkek adaptör naylon bağlantı (1/2 "x1 / 2") | ABD Plastik A.Ş. | 62178 | |
| Eluat-1 litre için örnek şişeleri | Fisher Scientific | 03-313-4F | |
| 60 ml şırınga | "Http://www.fishersci.com" target = "_blank"> Fisher Scientific | NC9661991 | |
| pH şeritleri | Whatman | 2614 991 | |
| Ön filtre, Polipropilen, 10 inç kartuş, 10 mikron | McMaster-Carr | 4411K75 | |
| Ön filtre konut | Cole-Parmer | S-29820-10 |
Kaynaklar
- US Environmental Protection Agency. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. EPA 815-R-05-002. , (2012).
- Cashdollar, J. L., Dahling, D. R. Evaluation of a method to re-use electropositive cartridge filters for concentrating viruses from tap and river water. J. Virol. Methods. 132, 13-17 (2006).
- Lambertini, E. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2990-2996 (2008).
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcription PCR assay for Type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Environment Agency. Optimisation of a new method for detection of viruses in groundwater. Report No. NC/99/40. , Environment Agency, National Groundwater and Contaminated Land Centre. West Midlands, United Kingdom. (2000).
- Vilaginés, P., Sarrette, B., Husson, G., Vilaginés, R. Glass wool for virus concentration at ambient water pH level. Water Sci. Technol. 27, 299-306 (1993).
- Vivier, J. C., Ehlers, M. M., Grabow, W. O. Detection of enteroviruses in treated drinking water. Water Res. 38, 2699-2705 (2004).
- Powell, K. L. Enteric virus detection in groundwater using a glass wool trap. In: Groundwater: Past Achievements and Future Challenges. Sililo, O. , Balkema, Rotterdam. 813-816 (2000).
- Hunt, R. J., Borchardt, M. A., Richards, K. D., Spencer, S. K. Assessment of sewer source contamination of drinking water wells using tracers and human enteric viruses. Environ. Sci. Technol. 44, 7956-7963 (2010).
- van Heerden, J., Ehlers, M. M., Heim, A., Grabow, W. O. Prevalence, quantification and typing of adenoviruses detected in river and treated drinking water in South Africa. J. Appl. Microbiol. 99, 234-242 (2005).
- Vilaginés, P. Round robin investigation of glass wool method for poliovirus recovery from drinking water and sea water. Water Sci. Technol. 35, 445-449 (1997).
- Gantzer, C., Senouci, S., Maul, A., Levi, Y., Schwartzbrod, L. Enterovirus genomes in wastewater: concentration on glass wool and glass powder and detection by RT-PCR. J. Virol. Methods. 65, 265-271 (1997).
- Pathogen losses in surface water runoff from dairy manure applied to corn fields. Borchardt, M. A., Jokela, W. E., Spencer, S. K. American Society for Microbiology General Meeting, New Orleans, LA, , (2011).
- Deboosere, N. Development and validation of a concentration method for the detection of influenza A viruses from large volumes of surface water. Appl. Environ. Microbiol. 77, 3802-3808 (2011).
- Lambertini, E. Virus contamination from operation and maintenance practices in small drinking water distribution systems. J. Water Health. 9, 799-812 (2011).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
