Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

Özet

Erişkin göbek orangeworm elektrofizyolojik yanıt (ölçümü ile hızlı ekran ana bitki uçucu için bir yöntem Amyelois transitella) Tek parça ve electroantennographic analizi ile karışır anten gösterilmiştir.

Özet

Bitki uçucu bitki-böcek ilişkisi önemli bir rol oynamaktadır. Otçul böceklerin konukçu bitki bulmak için kairomones olarak bilinen bitkinin uçucu, kullanın. ^1,2 bir konak bitki yetiştiricileri için ciddi ekonomik kayıplara sebebiyet böcek zararlıları ile önemli bir tarımsal emtia beslenme hasar olduğunda. Buna göre, kairomones cazibesine veya karıştırmayın bu böcekler ve böylece böcek kontrolü için pestisitlerin çevre dostu bir alternatif sunmak için cezbedici olarak kullanılabilir. ³ Ne yazık ki, bitkiler fenolojisi bağlı emisyon değişik kompozisyonlar ve oranları ile çok sayıda uçucu yayabilir emtia veya günün zaman. Bu biyolojik olarak aktif bileşenler veya uçucu bileşenler zorlu bir süreç karışımları belirlenmesi yapar. Biz laboratuvar tabanlı tarama biyoassay electroantennography (EAG) istihdam konak bitki uçucu emisyon biyoaktif bileşenler tespit yardımcı olmak. EAG değerlendirmek ve recor için etkili bir araçtırd elektrofizyolojik kendi antennal reseptörleri üzerinden bir böceğin koku yanıtları. EAG tarama süreci vaat eden biyoaktif bileşenleri tanımlamak için test uçucu sayısını azaltmaya yardımcı olabilir. Ancak, EAG biyoanalizlerin sadece reseptörlerinin aktivasyonu hakkında bilgi verir. Bu bileşik elicits böcek davranış türü hakkında bilgi sağlamaz; davranışsal yanıt cezbedici, tutmayan veya başka türü gibi olabilir ki. Uygun bir pozitif kontrole göre EAG tarafından önemli bir tepkinin uyarılmasında uçucu, genellikle zararlı böcek ve davranışsal tepkilerin ileri testler üzerine alınır. Deney tasarımı sundu olacak detay tek bileşenleri ve biyoassay EAG aracılığıyla bileşenlerin basit karışımları için yetişkin bir zararlı böcek göbek orangeworm (Amyelois transitella) elektrofizyolojik antennal yanıtların ölçümü ile ^4,5 badem tabanlı bir ana bitki uçucu taranmasında kullanılan metodoloji. Yöntemi iki eski kullanırcised antenleri bir "çatal" elektrot tutucu boyunca yerleştirilir. Burada gösterdi protokolü tarama Uçucu için hızlı, yüksek hacimli standart bir yöntem sunuyor. Uyaran düzeyini standardize etmek ve böylece antennal yanıtları göreceli chemoreceptivity göstergesi olmasını sağlamak için her uçucu bir dizi, sabit miktarda yer almaktadır. Negatif kontrol puf hem artık çözücü ve mekanik kuvvet elektrofizyolojik yanıt ortadan kaldırılmasına yardımcı olur. Pozitif kontrol (bu örnekte asetofenon olarak) kadın ve erkek göbek orangeworm (NOW) güve tutarlı bir yanıtı ortaya çıkardı, tek bir bileşiktir. Erkek ŞİMDİ güvesi ile tutarlı tepki verir ve biyoassay çalışmaları için kullanılan bir ek semiochemical standart (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, kadın üretilen seks feromon bir aldehit bileşeni. ^6-8

Protokol

1. Gösterim EAG için Konak Bitki gelen Tespit uçucu hazırlanması

1. GC-MS ile tüm uçucu uygun tanımlama ve kimlik doğrulama sonra, her mevcut uçucu EAG puf analizi gerçekleştirmek. Başlangıç ​​tarama süresinin kısa bir miktarda (Tablo 1) göreceli chemoreceptivity bir gösterge sağlamak için her bir cinsiyet antennal tepkilerin bir düşük kopyalayan numarası (N = 3-5) olabilir.
2. Pentan içinde 5 mg / ml konsantrasyonunda her uçucu bir çözeltisi hazırlayın. Sıkıca (örneğin, asetofenon, yoğunluğu = 1,03 g / ml, hacim = (0.005 g/1.03 g / ml) × 1.000 = 4.85 1.0 mL ölçülü balona asetofenon ile uL ve sulandırmak hemen kullanıma hazır olana kadar örnek mühür ve soğutmak 1,0 pentan ile mL).
3. Hemen önce EAG analizi için, test edilecek Uçucu maddeler arasında 5 mg / ml konsantrasyonda ihtiva eden şişeler kaldırmak ve oda sıcaklığına kadar ısınmasına izin verir. Bu arada, Pasteur pipetler için uygun sayıda etiketTest edilecek her uçucu ile korelasyon ve pipet ucu üzerinde parafilm küçük bir parça (yaklaşık 15 × 15 mm) sarın. Ilk tarama 10 uyaran pipetler için (N = 4, her erkek ve kadın için) kötü bir hazırlık ya da diğer öngörülemeyen bir engel halinde yüklenir.
4. Cımbız kullanılarak, yavaşça pipetle içine yerleştirilmesini kolaylaştırmak üzere ikiye katlamak bioassay diski, daha sonra kısmen ca böylece pipet ucu içine büyük katlanmış diski yerleştirin. Diskin 2-3 mm maruz kalmaktadır. Raf tutucu etiketli ve prepped pipetler hizalayın.
5. Bir pipet veya şırınga kullanılarak her diske uçucu solüsyon 10 L (50 mikrogram) yüklemek ve tam pipet içine diskleri takmadan önce geçmesi için 2 dakika bekleyin. Bir kez yüklenmiş, hemen parafilm (ca. 15 x 30 mm) ile, pipet ucu mühürlemek. Yüklenir ve kabarık olması uçucu teşvik miktarı en muhtemel böcek türleri ile değişecektir.
6. Aynı protokolü takiben yukarıda belirtildiği üzere kontroller hazırlamakHer bir analize içerir. Her diske sadece pentan negatif kontrol yükü 10 uL için, 2 dakika bekleyin etiketli pipet içine yerleştirin ve mühür. Pozitif kontrol için, disk üzerine 10 L (50 mg) yüklemek 2 dakika bekleyin, etiketli pipet içine yük ve parafilm ile mühür.
7. Böcek antennal prep yaşayabilirliği, büyük olasılıkla türler göre değişir, ama Amyelois transitella antenler tipik olarak tanımlanan protokol kullanılarak çıkarıldıktan sonra> 30 dakika için aktif kalması ve tutarlı bulduk. Bu kadar süre genellikle yukarı değerlendirilmek üzere 4-10 uçucu örnekleri için izin verecektir. Tablo 2 kez ve dizileri bir örnek sağlar.

2. Biyoassay EAG için Böcek Anten hazırlanması

1. Bu deneyin odak analizi EAG edilir; dolayısıyla, her araştırmacının uygun yetiştirilen böceklerin erişimi olacak varsayımı.
2. Bu deneme için biz ol 3-4 gün çalışıyor olacağımd, evlendirilen kız ve erkek güveler. Bireysel kelebekler küçük, kapaklı, plastik kap analiz gün aktarılır. Biyoassay hemen önce, test edilecek güve bir tutma aparatı (yani, çeşitli plastik pipet uçları yapılmış) ve arkasından güvenli bodoslama-ilk transfer edilir. Böceğin Manipülasyon eksizyonu kolaylaştırmak için düşük güçlü bir stereo-mikroskop altında görülebilir.
3. Anten bir tel uçlu aracını kullanarak dışarı alay edilir. Elektrot jeli küçük bir film ile çatal tutucu, antenlerin hızlı transfer için yakın yerleştirilir. İlk anten mikro makas kullanılarak çıkarıldı ve çatal üzerine yerleştirilir, antenin tabanı sağlanması çatal (kayıtsız toprak elektrot) of non-kırmızı bir kısmı üzerine yerleştirilir edilir. 10 dakika boyunca bir zamanlayıcı kümesi başlatıldı ve ikinci bir anten çatal aynı tarafta hem bazlar ile birinci antenin yanında çıkarıldı ve yerleştirilir.
4. Alternatif olarak, antenleri holdin içinde güvenli bırakılabilirg tüp çıkarılarak, sonra yavaşça tüp ve ucunda jel, orayı bir tel uçlu aracını kullanarak böcek arasındaki kaldırılır.
5. Anten tabanı ve ucu elektrot jeli dalmış emin olmak için kontrol ve kabarcık jel bulunmaz. Uçları / ipuçları elektrot jeli tam maruz garanti kesilmiş olabilir. Care her bir anten kalanı, böylece puf maruz maksimum antennal yüzey alanı garanti jeli ile kaplı emin olmak için kullanılmalıdır.
6. Prepped çatal sonra prob pre-amplifikatör içine yerleştirilir ve 200 ml / bekleme süresi 10 dakika kalan süre dakikada nemlendirilmiş sabit bir hava akışı altında tutulur. Hava / puf akış 2-3 mm yönlendirmek için ayarlanabilir olduğu zaman ve tüketim inisiyasyon kez EAG belirtilmiştir (Tablo 2) ve birinci uyaran puf önce 30 saniye, pozitif kontrol içeren pipetle sonuçlandırılmamış ve tutucu yerleştirilir antenler prepped.
7. Her exper sonraiment, testi güveler bir kuru buz ortamda ötenazi ve düzgün bir şekilde bertaraf edilmektedir.
8. Erkek kelebeklerin çiftleşme durumunu kontrol etmek için disseke edilir. Birlikte yaşayan erkek evlendirilen olduğu varsayılmaktadır.

3. Bireysel Bileşenleri için Protokol EAG

1. Antennal yanıtları Syntech EAG aleti ile birlikte AutoSpike yazılım aracılığı ile kaydedilir. EAG probu ile kanal için AutoSpike Özellikler sekmesindeki yapılandırma 106.7 bir örnekleme oranı, NO düzeltmek için ve 0-42 Hz bir filtre olarak belirlenmiştir. Filtre sekmesini için EAG filtre ON ve düşük kesme 0.1 Hz olarak ayarlanır.
2. Stimulus ponponları süresi 1-2 saniyedir. 1 dakika için ayarlanmış bir zamanlayıcı her nefeste sonra başlatılır.
3. Sonraki test uçucu pipet mühürsüz ve tutucu yerleştirilir. Randomize arasında, test uçucuların, dizisi, hiçbir test bileşikleri sürekli olarak başka bir test uçucu takip sağlamak için çalışır daha sonra takip eder (örneğin, Tablo 2) dikkatle allowiponponları arasındaki ng 1 dakika.
4. EAG yanıtları okuma kolaylığı sağlamak için, hükümdarlar kısımlarını bilgisayar ekranında yerleştirilir ve Çökmelerin sinyal apekse temel düzeyde mm ölçülen ve bir veri sayfası (yani, 5 mV ayarı için, 33 mm oturum = 2.5 mV). Yazılım gelecek analizi için kaydedilen kayıtların oynatma yeteneğine sahiptir. MV ya μV amplitüd birine mm arasında dönüşüm sonrası veriler analiz yapılır.
5. Son pozitif kontrol puf (örneğin, kayıt # 12) uygulandığında sonra, antenleri kaldırılır, çatal, etanol-doymuş silin ile temizlenir ve sonraki kullanımdan önce kurumaya bırakılır.
6. Tahlillerin verimi artırmak için, antenlerin sonraki bölümün çıkarılması yaklaşık 10 dakika güncel deney bitmeden ikinci bir laboratuvar personeli tarafından başlatılmış olabilir - Dördüncü puf sonra; mevcut Deneyin ikinci testi uçucu, Masa başı olarak 2. Bu fo sağlayacakr doğrudan geçerli deney bittikten sonra bir sonraki deney başlamadan.
7. Tekrarlamalı Yüksek sayısı (farklı antenler üzerine) daha ileri istatistiksel doğrulama sağlamak ilgi bileşikler üzerine yapılabilir.

4. Karışımlar veya Diğer Matrisler EAG Analizi Örneği (Tablo 3)

1. Sonra, iki üçüncül karışımları (3-bileşenli karışımları) için hacim oranları ve yüksek EAG tepkileri (Tablo 4) eliciting uçucuların birleştiren bir örneği sağlamak için hesaplanır. Daha sonra 2-phenylethanol ve 01:02:04 ikinci bir karışım oranı ile karşılaştırarak: 2-undecanone: hesaplamalar bazı temel oranları, α-humulene bir 01:01:01 molar oranı içindir.
2. Benzer protokolleri kullanarak daha önce, karışım hazırlanır ve etiketli Pasteur pipetler gerekli pozitif ve negatif kontrollerle birlikte yüklenir tarif edilir.
3. Uçucu örnekleri ve erkek antenler arasında kabarık ve yanıtları ölçülür ve oturumbir veri sayfası (Tablo 3).

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Kadın göbeği orangeworm için aşağıdaki ayarları kullanılır: 2 saniye ponponları, 10 saniyelik kayıt süreleri, 10 saniyelik penceresi ve 5 mV ölçek. Negatif bir sapma tipik tepki, henüz mutlak değeri (örneğin, -3400 μV saptırma 3,400 μV olarak kaydedilir) kaydedilir. Pozitif kontrol için hazırlık A nispeten zayıf tepki atılır. Şekil 1 göbek orangeworm tarafından pozitif kontrol yanıtı zayıf bir grafiksel bir temsilini sağlar.

Zayıf bir kontrol sonucu Örneğin, asetofenon için ortalama kadın antennal tepkisi tipik olarak ca. 2.600 μV (Şekil 2), hazırlık sadece ca bir yanıt verseydim. 1.300 μV atılır ve antenler başka bir çift prepped olacaktır. Benzer şekilde, ortalama bir erkek tepkisi (Z, Z) -11,13-hexadecadienal typicall idiy 3000 μV, bu yüzden, herhangi bir yanıt az 1.500 'den μV tipik olarak atılmıştır.

Her bir deney başlamadan ve sonunda da pozitif kontrol antenler durumu ile ilgili bilgi sağlar. Sonrası kontrolü (kayıt # 12, Tablo 2) puf için antennal yanıtı öncesi kontrol ^1. puf (kayıt # 1 az% 75 ya eğer biz hızlı bir tarama için takip etmeniz gereken bir kuraldır Tablo 2) ya da ön-kontrolü (kayıt # 2, Tablo 2) daha sonra deney (Şekil 3) bağlı prep olası degradasyona veri analizi kullanılan değildir ve ^2. puf daha azdır. Başparmak ilk kuralı bir örneği kayıt # 1 olurdu = 2,730 μV ve kayıt # 12 = 1.680 μV ve başparmak ikinci kural varsa, bu durumların her birinde kayıt # 2 = 2.350 μV ve kayıt # 12 = 1.680 μV, , hazırlık ve deney sonuçlarını iptal olacaktır.

Aolarak pozitif kontrol için ölçülen EAG yanıt değerleri düzeltmek temsili örnek aşağıdaki gibi olacaktır.

# Run	EAG (V)	# 2 Run	EAG (V)	# 3 çalıştırın	EAG (V)
(+) Ctrl	2800	(+) Ctrl	2420	(+) Ctrl	3030
Bir Cmpnd	3000	Bir Cmpnd	2500	Bir Cmpnd	3440
(-) Ctrl	530	(-) Ctrl	755	(-) Ctrl	910
Cmpnd B	2400	Cmpnd B	2000	Cmpnd B	2560
(+) Ctrl	2770	(+) Ctrl	2400	(+) Ctrl	3020

Bir N = 3 deneyi için yukarıda değerleri kullanılarak, negatif kontrol tepkisi negatif kontrol mekanik puf ve artık çözücü için taban antennal tepkisi olduğu varsayımını altındaki her bir deney içindeki her bir değeri çıkarılır.

# 1 çalıştırın	EAG (V)	# 2 Run	EAG (V)	# 3 çalıştırın	EAG (V)
(+) Ctrl	2270	(+) Ctrl	1665	(+) Ctrl	2120
Bir Cmpnd	2470	Bir Cmpnd	1745	Bir Cmpnd	2530
(-) Ctrl	0	(-) Ctrl	0	(-) Ctrl	0
Cmpnd B	1870	Cmpnd B	1245	Cmpnd B	1650
(+) Ctrl	2240	(+) Ctrl	1645	(+) Ctrl	2110

Her bir deney için pozitif kontroller sonra ortalama ve 1,000 μV için düzeltme oranı belirterek, 1000 μV için düzeltilmiş olacaktır. Bir veri sayfası (örneğin, Excel) kolay kullanılabilir veri yanıtları dönüştürmek için manipüle edilebilir.

# 1 çalıştırın	Ort (V)	# 2 Run	Ort (V)	# 3 çalıştırın	Ort (V)
(+) Ctrl	2255	(+) Ctrl	1655	(+) Ctrl	2115
(+) Ctrl adj.	1000 (0.443)	(+) Ctrl adj.	1000 (0.604)	(+) Ctrl adj.	1000 (0.473)

Her deney içinde düzeltme oranı ile çarpılması, bileşik için değerler A ve bileşik B daha sonra ayarlanır.

# 1 çalıştırın	Adj. EAG (V)	# 2 Run	Adj. EAG (V)	# 3 çalıştırın	Adj. EAG (V)
Bir Cmpnd	1094	Bir Cmpnd	1054	Bir Cmpnd	1197
Cmpnd B	828	Cmpnd B	752	Cmpnd B	780

Her bileşik için ortalamalar (vasıtası) daha sonra daha sonra değerlendirilebilir test bileşikleri için diğer ilgili veriler ve istatistiksel EAG yanıtları ile birlikte belirlenendaha fazla araştırma için adaylığı için.

Bileşik	EAG (V)	No çalıştırır, N =
A	1115	3
B	787	3

Şekil 1. Antenleri olduktan sonra fakir antennal tepkisi nedeniyle iptal olacağını ön kontrol ^(1. Pozitif kontrol puf) için erkek antennal yanıt (1,180 μV) Temsilcisi EAG jel ile iyi temas var. Alt pencereler Mavi bar uçucu iki ikinci puf temsil eder. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Trong> Şekil 2. için kadın antennal yanıt (3,400 μV) Temsilcisi EAG ^1. puf uygun olarak düşünülebilir ön kontrolü. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3. Kadın antennal yoksul olarak düşünülebilir sonrası kontrolü yanıt (1,680 μV) (her bir deney için son pozitif kontrol) ve antenleri bozulması (<75 ^1. ön kontrol veya% 2. puf değer). Bu örnek için ^1. ön kontrol puf ön kontrol puf 2.350 μV oldu 2,730 μV ve ^2. oldu. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

"dflinebreak>
Şekil 4. Bir aday uçucu harmanından puf için dişi antennal yanıt (3800 μV) ve en çok başlangıç ​​saptırma (3800 μV), puf süresi sırasında ilk eğimi (daha sonraki ölçümler için EAG Örnek 0,3 s/1.2 mV = 0.25 s / mV) ve kalan puf süre için eğim (1.6 s/1.9 mV = 0.84 s / mV). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Örnek bir matris ve ilişkili uçucu içeren Şekil 5. Küçük modifiye gemi A. arasında söndürdü edilecek transitella antenler.

ad/3931/3931table1.jpg "/>
Tablo 1. Autospike programında farklı ve daha az duyarlı yapılandırması tarafından belirlenir Nonpareil badem (2007) ve EAG yanıtları yerinde uçucu emisyon olarak.

Tablo 2. Bireysel uçucu bileşenleri, kadın ve erkek antennal yanıtları kaydetmek için bir form örneği.

Tablo 3. Uçucu karışımları ve / veya buketleri, kadın ve erkek antennal yanıtları kaydetmek için bir form örneği.

Tablo 4. Karışımları, iki farklı oranları için, bir 5 mg / mL çözelti 10 mL hazırlama örnekleri.

Tablo 5. Ve erkek anten üzerinden tek uçucu bileşenlerin üst üste iki ponponları kayıt formu örneği.

Tartışma

Bir hedef böcek chemoreception yanıtları belirlemek için bir biyoassay olarak electroantennogram kayıtların kullanın gaz kromatogramı (GC-EAD) gelen atık için bir dedektör olarak EAG kullanan çalışmaları literatürde bulunabilir oldukça yaygın ve çok sayıda olduğunu. ^9,10 yöntemi gösterdi göreceli yanıt emindir atama için yüksek tekrarlı olarak uçucu bileşenlerin eşdeğer miktarda hızlı bir tarama sağlayacaktır. Biz "tarama" değer olarak burada mevcut antenlerden maksimum sehim genlik sinyal (...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Asetofenon	Alfa-Aesar	A12727	Bayan pozitif kontrol
(Z, Z) -11,13-Hexadecadienal	Suterra		Erkek pozitif kontrol
α-Humulene	Aldrich	53675	Seskiterpen
2-Undecanone	Aldrich	U1303	Yağlı asit türevi
2-Phenylethanol	Aldrich	77861	Benzenoid
Pentan	EMD	PX0167-1	Çözücü
4-Kanal edinimi denetleyici	Syntech	BenDAC-4
EAG prob, pre-kuvvetlendirici	Syntech	Tip PRG-2
Anten tutucu	Syntech	PRG-2 için	Çatal elektrot
Stimulus denetleyici	Syntech	CS-55	Hava akışı ve ponponları
Spectra Elektrot Jel	Parker	12-02
Biyoassay diskler	Whatman	2017-006	6 mm
Pasteur pipetleri	VWR	14673-010	5 ¾ "(14.6 cm)
Parafilm M	Bemis	PM-992