1. Taze Çalışma Çözümler hazırlayın
- TBS: 0.05 M Tris Salin, pH 7.8 (TBS) Tamponlu. 60 ml TBS / mikroplak hazırlayın.
- KKE: Domuz pankreatik elastaz, tip 1 (PPE) bir süspansiyon olarak sağlanmıştır. Iyice çalkalayın ve yaklaşık 0.01 U / ml TBS KKE sulandırın. 6 ml) solüsyonu / mikroplak çalışma hazırlayın.
- SA 3 NA: Sukkinil-L-Ala-Ala-L-L-Ala-p-nitroanilid (SA 3 NA). Dimetil sülfoksit (DMSO) 0.1 M stok SA 3 NA çözeltisi hazırlayın ve -20 ° C'de hemen kullanmak veya saklamak Stok SA 3 NA çözüm TBS içinde 1/100 sulandırarak 6ml çalışma çözüm / mikroplak hazırlayın.
- Coomassie MAVİ: TBS% 10 Coomassie Brillant Blue R-250 (Coomassie Mavi) bir stok çözeltisi hazırlayın ve -20 ° C'de hemen veya depoyu kullanın TBS içindeki stok solüsyonu 1/1000 seyreltilmesi ile 6 ml çalışma çözeltisi hazırlayın.
2. Tükürük hazırlayın
- Saliva KOLEKSİYON: duran konumda, örneğin ağız içinde sitrik asit veya sakızı gibi bir sialogogue yerleştirerek tükürük içine serum eksudasyon uyarır. Bir şekersiz damla limon sık dişsiz ve sakız çiğnemek edemiyoruz HIV-1 hastaları için uygundur. İlk 3 dakika boyunca gerektiği gibi yutmak ve sonraki 3 dakika için bir maskeli kabına tüm ağız tükürük toplamak. Bu, tükürük yaklaşık 2 ml sağlayacaktır. -80 Azından hemen kullanın veya saklamak ° C
- Saliva TAŞIMA: Eğer 37 ° C ve buz üzerinde yerde donmuş, çözülme örneği. 2-4 taze veya çözülmüş örnek ° C'nin 3 gün en fazla. Vorteks değil tükürük Sahibi ve bir serum eksuda içeren musin pipetleme kaçının. Tükürük işlerken Standart Önlemler kullanın http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .
3. Mikroplaka Set-up
- TAMPON: Ölçümler üç nüsha halinde yapılır. , Bir mikrotitre plakası her bir kuyucuğa 130 uL TBS eklenir.
- ÖRNEKLER: her bir test için de, 150 ul / kuyucuk bir son hacim 20 uL tükürük eklenir. Kabarcıklar tanıtma olmadan pipetleme ile karıştırın.
- KONTROLLER: Pozitif kontrol KKD içerir, ancak tükürük. Negatif kontrol tükürük içerir, fakat herhangi bir PPE.To pozitif kontrol de 20 uL TBS eklenir. Negatif kontrol etmek de 20 uL tükürük eklenir.
- KKE KULUÇKA: KKD çalışma çözümü iyice çalkalayın. De negatif kontrol kuyuları hariç her 50 uL KKE çalışma solüsyonu eklenir. Negatif kontrol kuyuları için, 50 uL TBS ekleyin. 23 ° C'de 10 dakika inkübe
- SUBSTRAT KULUÇKA: Her bir kuyuya 50 uL SA 3 NA çalışma çözeltisi ekleyin. 23 ° C'de 45 dakika inkübe
- Coomassie MAVİ:. 50 uL Coomassie Mavi çalışma çözüm Ekle
- OKUMA: mikroplaka okuyucu absorbans, aktif α 1 PI ve protein içeriği temsil Coomassie Mavi algılamak için bir 595 nm temsil SA 3 NA bölünme algılamak için bir 405 nm okuyun.
4. Α 1 PI Endeksi hesaplayın
- ORTALAMA BİR 405 nm VE 595 nm normalleştirmek: Her üç nüsha için, ortalama hesaplamak. Numune ortalama Negatif Kontrol ortalama çıkarın. Plaka-to-plaka değişimi en aza indirmek için, aşağıdaki gibi Pozitif kontrol ortalama her Numune ortalama bölerek ortalama normalize:

- Α 1 PI INEX HESAPLAYIN: normalize A 595 nm ile 405 nm bir normalize bölün:

5.. Temsilcisi Sonuçlar
Endemik, kaynak sınırlı bölgelerde CD4 sayısı izlemek için bir nokta-bakım tarama testi olarak α-test kullanımı için uygun olup olmadıklarını belirlemek için, uyarılmış tükürük 20 kadın toplandı ve 11 erkek HIV-1 konular katılıyor kliniği için Kamerun rutin bakım. New York'ta toplanan tükürük kullanarak α-testinin geliştirilmesi sırasında ön gözlemler ile tutarlı, tükürük α 1 PI Endeksi CD4 sayısı (r 2 = 0.91, p <0.0001. N = 31) ile korele Kamerun toplanır. Ilişki bir doz-yanıt ilişkisi (Şekil 2A) ile tutarlı bir 3-parametreli sigmoidal eğri olarak tanımlandı. % 95 güven ve tahmin aralıkları sırasıyla mavi ve kırmızı çizgiler, (Şekil 2B) ile birlikte tasvir edilmektedir.
Içindeönceki bir çalışmada, CD4 + T hücreleri dönemsellik 23 sinüs bisiklet ± HIV-1 dersten ve α 1 PI eksikliği (Pizz) 3 miras versiyonu olan olgularda 3.5 gün sergilediği belirlenmiştir. Tasvir burada 27 gün periyodisite (Şekil 3A) sergileyen olmayan bir HIV-1 Sağlıklı kontrol bisiklet CD4, bilgisayar tarafından üretilen sinüs eğrisi analizi temsili bir örnektir.
CD4 Bilgisayar oluşturulan sinüs eğrisi analizi + 6 konularda T hücre değişiklikleri salınım 3 tepe-tepeye genlik ve eksen değerlerini vermiştir. Beklendiği üzere, salınım ekseni genlik (r 2 = 0.96, p = 0.009, n = 6) (Şekil 3B) ile korele idi. Hastalarda olacak düşük CD4 + T hücre sayısı, CD4 T hücre sayısı siklik değişiklikler küçüktü ve yüksek CD4 + T hücre sayısı olan hastalarda, siklik değişiklikler büyüktü.
ÇünküŞekil 2 içinde gösterildiği regresyon hattı salınımı ve salınım ekseninin ekseni amplitüd bağlı olarak değişebilir etmek ve böylece regresyon hattı CD4 + T hücreleri beklenir ne kadar yukarıda ve aşağıda tahmin regresyon çizgisi için hesaplanan edilebilir, amplitüd ile ilişkilidir tahmin bisiklet (Şekil 3C). Şekil 3C ve Şekil 2B hesaplanan güven aralığı hesaplanan genlik overlaying, genlik (yeşil hat)% 95 içinde yer olduğu tespit edilmiştir güven aralığı (mavi çizgi) (Şekil 3D).

Şekil 1.. Prosedür Özet: ağızda Yeri sitrik asit ve tükürük toplamak. Üçlü bir mikroplaka kuyu için seyreltilmiş tükürük ekleyin. Her oyuğa PPE ekleyin ve 23 ° C'de 15 dakika süreyle inkübe Her oyuğa PPE substrat ekleyin ve 23 ° C'de 45 dakika süreyle inkübe. Coomassie Mavi ekleyin ve PPE aktivite tespit etmek ve 595 nm de proteini tespit etmek için 405 nm de okunur.

Şekil 2. Standart CD4 numaralandırma yöntemi ile α-testi karşılaştırılması. A) α-test uyarılan tüm ağız tükürük α 1 PI Endeksi miktarlarının tarafından yapıldı. CD4 sayısı standart akım sitometri kullanılarak bağımsız bir tıbbi laboratuvar tarafından yapıldı. Akım sitometri ve tükürük için kan aynı klinikte ziyaret toplandı. Α 1 PI Endeksi ve CD4 sayıları arasındaki ilişki, bir 3-parametreli sigmoidal eğrisi (r 2 = 0.91, p <0.0001, n = 31). B)% 95 güven aralıkları ve tahmini mavi ve kırmızı olarak tasvir edilmektedir tanımlandı sırasıyla hatları,.

Şekil 3. CD4 c hesaplama Doğrulukα1PI Index.A kullanarak ounts) CD4 + T hücreleri olmayan bir HIV-1 sağlıklı kontrol 27 günlük periyodik sinüs bisiklet sergiledi. Salınım ekseni tasvir edilir (kırmızı noktalı çizgi). B) T hücre bisiklet 4 HIV-1 kişilerde salınım peak-tepe genliği ve eksen hesaplamak için kullanılan CD4, 1 sigara HIV Bilgisayar üretilen sinüs dalga analizi -1 Pizz konu ve parçası A. CD4 arasındaki ilişkiyi tasvir olmayan HIV-1 sağlıklı kontrol T + hücre genlik ve salınım ekseni 3-parametreli sigmoidal eğrisi (r 2 = 0.96, p = 0.009, n kabul edildi = 6). C) parçası B) 'de elde edilen salınım genlik ve ekseni arasındaki ilişkiyi sigmoidal Şekil 2 den regresyon hattı (siyah çizgi) boyunca nokta, beklenen amplitüd (yeşil hatlar) hesaplamak için kullanılmıştır. GE) beklenen amplitüd aralığı (yeşil hat)% 95 güven aralığı (belirgin olarak farklı bulunduolarak Mann Whitney Rank Sum Testi ve genlik hattı ve regresyon hattı (37 hücreleri arasındaki ortalama fark (% 95 güven aralığı ve regresyon hattı (63 hücre / ml arasındaki ortalama fark karşılaştırılmasına dayanarak) tarafından belirlenen mavi çizgiler) / ml), p = 0.001).