Α-testi: Tüm Tükürük Kullanarak Hızlı Hücre içermeyen CD4 sayımı

Özet

A CD4 numaralandırma yöntemi, α-testi, hızlı ve doğru CD4 sayımları sağlamak üzere tam tükürük kullanan tarif edilmektedir. Α-test maliyetleri pennies ve bu monoklonal antikorlar, enstrümantasyon, soğutma, numunelerin taşınması gibi toplama ve kan işleme gibi teknik eğitim, pahalı reaktifler için gereksinimini ortadan kaldırır.

Özet

HIV hastalığı izlemek için uygun fiyatlı CD4 sayımı için acil bir ihtiyaç vardır. CD4 sayımı kan hücreleri, sadece şu anda kabul edilebilir bir yöntem üzerinde CD4 ölçmek için özellikle monoklonal antikorlar zaman ve sıcaklık sınırlamaları, teknik gelişmişliği ve reaktiflerin maliyeti nedeniyle kaynak sınırlı bölgelerde, ulaşamayacağı. Yaygın olarak kullanılan bir maliyet tasarrufu ve zaman tasarrufu sağlayan laboratuvar stratejisi yerine tedbir bazı kan değerlerinin daha hesaplamaktır. Örneğin, LDL düzeyleri total kolesterol, HDL, trigliseritler ve ¹ ölçülen seviyeleri kullanılarak hesaplanır. Bu nedenle, doğrudan CD4 ⁺ T hücre sayısı CD4 hesaplanması için doğru bir yöntem sağlayabilir regüle hücre içermeyen ögelerinden tanımlama ögelerinden fizyolojik ilgisi nedeniyle sayılır.

Kan girin ve CD4 ⁺ T hücreleri dolaşımdaki olmaya yazgılı olan kök hücrelerin sayısı bir kemokin CXCL12 tarafından belirlenirnd reseptörü lokomosyon ² üzerindeki etkisi nedeniyle CXCR4. Kana kök hücre hareketin süreci ayrıca hücre yüzeyinde insan lökosit elastaz (HLE _CS) ve HLE _CS-reaktif aktif α ₁ proteinaz inhibitörü (α ₁ PI, α ₁ antitripsin, SerpinA1) ³ ile düzenlenir. HIV-1 hastalığı, α ₁ PI hastalığı süreçler ⁴ gerçekleşmemesinden dolayı inaktive edilir. HIV-1 hastalığının erken asemptomatik kategoride, aktif α ₁ PI arıtılmamış, HIV-1 hasta (medyan = 12 uM ve semptomatik kategoriye ^{4, 5} sırasında normal düzeyinin elde edilmesi için% 100 olarak normalin altında olduğu bulunmuştur. Bu desen değil yetersiz sentezi, proteolitik inaktivasyon veya oksijenasyonu, bağışıklık inaktivasyon atfedilmiştir. Biz> 220 CD4 hücre / ul HIV-1 kişilerde, CD4 sayısı (r ² aktif α ₁ PI serum düzeyleri ile ilişkili olduğu görüldü = 0.93, p < 0.0001, n = 26) ve inaktif α ₁ PI (r ² = 0.91, p <0.0001, n = 26) ^5. HIV-1 enfekte olan ve olmayan konulara α ₁ PI İdaresi α ₁ PI CD4 sayısının düzenleyen katılır ⁺ T hücreleri kan ³ düşündüren CD4 sayısı dramatik artış ile sonuçlanmıştır.

Stimülasyon ile, tüm tükürük aktif α ₁ PI ve bu ölçüm korelasyon ölçümü bunu CD4 sayıları hesaplamak doğru bir yöntem olduğunu kanıtlayan izin vermek için yeterli seröz eksuda (plazma tükürük içine kan damarı duvarlarının geçer proteinli madde içeren) içerir. Kısaca, bu sakız veya sitrik asit gibi sialogogues tüm ağız tükürük içine serum eksudasyon uyarır. Serum eksudasyon uyararak sonra, tükürük serum α ₁ PI aktivitesi elastaz aktivitesini inhibe etme kapasitesi ile ölçülür. Domuz pankreatik elastaz (KKE)elastaz bir hazır ucuz bir kaynağıdır. PPE kendine özgü substratlar, kolorimetrik peptid bir tanesi, sukinil-L-Ala-Ala-L-L-Ala-p-nitroanilid (SA yarma gelen PPE önleyen bir bire-bir kompleks oluşturarak α ₁ PI bağlanır ³ NA). Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PPE bir satüre konsantrasyonu ile kuluçkaya tükürük tükürük tüm aktif α ₁ PI için KKD'nin bağlayıcı sağlar. Aktif α ₁ PI KKD'nin edilen inhibisyon PPE substrat SA ³ NA. (Şekil 1) eklenmesi ile ölçülebilir. CD4 sayımları kan hacmi (CD4 hücre / ul) cinsinden ölçülür rağmen, tükürük α ₁ Pİ konsantrasyonu hacmi gün ve kişi süresince önemli ölçüde değişebilir değil tükürük hacmi beri, tükrük serum konsantrasyonu ile ilgilidir ⁶ kişi için. Ancak, tükürük neredeyse tüm protein serum içeriği nedeniyle ve tükürük protein içeriği mea olduğunu⁷ surable. Böylece, tükürük aktif α ₁ PI tükürük protein içeriği bir oranı olarak hesaplanır ve α ₁ PI Endeksi denir. Sonuçlar burada α ₁ PI Endeksi CD4 sayıları hesaplamak için doğru ve kesin fizyolojik bir yöntem sağladığını göstermiştir sundu.

Protokol

1. Taze Çalışma Çözümler hazırlayın

1. TBS: 0.05 M Tris Salin, pH 7.8 (TBS) Tamponlu. 60 ml TBS / mikroplak hazırlayın.
2. KKE: Domuz pankreatik elastaz, tip 1 (PPE) bir süspansiyon olarak sağlanmıştır. Iyice çalkalayın ve yaklaşık 0.01 U / ml TBS KKE sulandırın. 6 ml) solüsyonu / mikroplak çalışma hazırlayın.
3. SA ³ NA: Sukkinil-L-Ala-Ala-L-L-Ala-p-nitroanilid (SA ³ NA). Dimetil sülfoksit (DMSO) 0.1 M stok SA ³ NA çözeltisi hazırlayın ve -20 ° C'de hemen kullanmak veya saklamak Stok SA ³ NA çözüm TBS içinde 1/100 sulandırarak 6ml çalışma çözüm / ....

Tartışma

Seyreltilmemiş Serum median 36 mM içeren α ₁ PI ve 3.6 mM α ₂ makroglobulin (α ₂ M) 10 kat farkı ^8. Her iki protein KKD bağlanmak için yarışırlar. Bu iki özellik, konsantrasyon ve PPE yakınlığı, özellikle α ₂ M ⁸ rakip varlığında, normal serum α ₁ PI ölçebilen bir yöntem geliştirmek için istismar edilmiştir. Bu yöntem,% 0.3 serum az 50 nM μ ₁ PI algılayabilir. % 2,5 serum dilüsyonunda, KKD'ler için α ₂ M bağlayıcı sapt.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
Sialogogue, 0.05M sitrik asit	Eda en tatlandırılmamış Şekerleri, 4900 Arka N.20th Street, Philadelphia, PA 19144	Şeker-Free limon damlatarak
Domuz pankreatik elastaz, tip 1 (AK 3.4.21.36)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63.103	E1250
Sukkinil-L-Ala-Ala-L-L-Ala-p-nitroanilid	Sigma-Aldrich	S4760
Coomassie Brillant Blue R-250	Sigma-Aldrich	B7920
Doku kültürü ile tedavi edilen, 96 mikroplaklar	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886	35-3072
405 nm ve 595 nm filtreleri ile Mikroplaka Okuyucu	MTX Lab Sistemleri, 8456 Tyco Road, Building D, Viyana, Virginia 22.182	Dynex P97277