Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Summary

Biz burada artık rutin stabil bağlı ribozom doğmakta olan zincir kompleksleri (RNCs) izole etmek için kullanılan bir tekniği açıklar. Bu teknik bir 17 amino asit uzunluğunda SECM "tutuklama" dizisi bir prokaryotik çeviri uzama durdurmak olduğunu keşif yararlanır ( E. coli Hemen hemen herhangi bir proteinin (ya da C-terminali ile kaynaşmış) içine yerleştirilir) sistem.

Abstract

Kapsamlı araştırma hücrede protein katlanması eş öteleme işlemi ^1-5 olduğunu düşündüren yeterli kanıt sağlamıştır. Ancak, polipeptid zinciri işlevsel formunu elde etmek için işbirliği translasyonal katlama sırasında izlediği kesin yolu hala bir muammadır. Bu proses anlamak ve co-translasyon katlama aramaddelerinin tam konformasyon belirlemek amacıyla, bu da daha fazla yapısal analizi izin vermek için önceden belirlenmiş bir büyüklükteki olgunlaşmamış zincirler taşıyan RNCs izolasyonu izin teknikleri geliştirmek için gereklidir.

SECM (sekresyon monitör) 170 amino asit olan E. SECM-seca operon ⁶ içerisinde aşağı SecA (salgılanması sürüş) ATPase ekspresyon düzenleyen coli proteini. Nakatogawa ve Ito başlangıçta SECM proteininin C-ucu bölgesi içinde bir 17 amino asit sekansı, uzun (150-FSTPVWISQA QGIRA g p-166) için yeterli ve gerekli olduğu bulunduböylece peptidil-glisil-tRNA stabil ^7-9 P-site ribozomal bağlı üreten, Gly165 az SECM uzama durmasına neden olur. Daha da önemlisi, bu 17 amino asit sekansı, uzun, böylece önceden belirlenmiş boyutlardaki ⁷ olgunlaşmamış zincirler taşıyan RNCs üretimini sağlayan hemen hemen herhangi bir tam uzunlukta ve / veya kesilmiş proteininin C-ucu oluşturacak şekilde eklenebilir olduğu bulunmuştur. Böylece, hedef proteinin içine kaynaşmış ya takıldığında, SECM durdurduklarını sekansı polipeptid zinciri uzama durması üretir ve E. in vivo hem de istikrarlı RNCs üretir coli hücreleri ve hücre içermeyen sisteminde in vitro. Sakkaroz degrade santrifüj daha RNCs izole etmek için kullanılır.

İzole RNCs co-translasyon katlama aramaddelerinin yapısal ve fonksiyonel özellikleri analiz etmek için kullanılabilir. Son zamanlarda, bu tekniğin başarılı birçok ribozom bağlı doğmakta zincirleri ^10,11 yapısı içgörü kazanmak için kullanılmıştır. Burada sığır Gamma-B kristalen izolasyonu tarif SECM için erimiş ve in vitro çeviri sistemi bir oluşturulur RNCs.

Protocol

1. Şablon DNA hazırlanması ve in vitro transkripsiyonu sonucunda

1. Ilgi genindeki bir T7 ve / veya örneğin plazmid göre SP6 promoter içinde klonlanmış edilir. Ilgi RNCs elde etmek için, polipeptid hedef C-terminali SECM FXXXXWIXXXXGIRAGP ⁷ durması indükleyici dizisinin eklenmesi ile uzar. Ilgi polipeptid fragmanı ribozom tünel dışarı a'ya emin olmak için, hedef protein C-ucu kısmı ^12-14, en azından 30 amino asitleri ile uzatılabilir zorundadır. Esnek bir Glisin-serin zengin bir bağlayıcının herhangi bir olası konformasyonel kısıtlamaları önlemek için, protein ve SECM durması dizisi arasında sokulabilir.
2. In vitro

Discussion

In vitro transkripsiyonu ve çeviri için kullanılan bileşenlerin tekrarlanabilir sonuçlar, kalite ve konsantrasyonu için kritiktir. Biz in vitro transkripsiyon ve çeviri özleri içinde piyasaya kullanmış ve dikkatli eğer onlar, verimli ve tekrarlanabilir sonuçlar verir. MRNA Kalite çeviri etkileyebilir, bu nedenle in vitro çeviri için kullanmadan önce mRNA bütünlüğünü test etmek için büyük önem taşımaktadır. In vitro çeviri için inkübasyon süresi, proteinin uzunluğu il.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / Kit Adı	Şirket	Katalog numarası
MEGAscript T7 Yüksek verim Transkripsiyon Kiti	Ambion	AM1333
RTS 100 E.coli HY Seti	5 Başbakan	2401100
Ribonükleaz İnhibitör	Invitrogen	15518012
Trans [35 S]-Etiket	MP Biomedicals	0151006
Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre Ünitesi	Millipore	UFC801008
Depolama fosfor otoradyografi	GE Healthcare	Typhoon 9410 değişken modunu görüntüleme
Yoğunluk Gradient Fraksiyonasyon Sistemleri	Teledyne Isco, Inc	ISCO Programlanabilir Yoğunluk Gradient Sistemi
Sakkaroz Gradient Centrifugation	Beckman Coulter	Optima L-90 K Preparatif ultrasantrifüjdeki