Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Özet

Grip virüsleri konak hücre kromatin ile birlikte kendi RNA genomu çoğaltmak. Burada, enfekte olmuş hücrelerin kromatin gelen sağlam virüs ribonükleoprotein kompleksleri arındırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Viral kompleksleri Arıtılmış sırasıyla, Western blot ve protein ve RNA içerikleri astar uzantısı hem de analiz edilebilir.

Özet

Tüm negatif dallı RNA virüsleri gibi, influenza virüs genomu tek zincirli genom nükleoprotein (NP) tarafından kapsül içine, ve oluşan trimeric polimeraz kompleksi ile ilişkili olduğu viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNP), formunda paketlenmiş PA, PB1 ve PB2 alt birimlerinin. Bununla birlikte, çoğu RNA virüslerinin aksine, influenza virüs enfekte olmuş hücreler, çekirdeklerinde viral RNA'nın sentezi gerçekleştirmek. İlginçtir, viral mRNA sentezi primer olarak hücresel öncesi mRNA'ların kullanır ve bu süreç kromatin ¹ gerçekleşir ileri sürülmektedir. Viral polimeraz ve konak RNA polimeraz II yanı sıra, NP ve ev sahibi arasındaki nükleozom arasındaki etkileşimlerin da ^1,2 karakterize edilmiştir.

Yakın zamanda, bir tek Strep-Tag kodlayan rekombinant influenza virüsünün üretimi genetik olarak viral polimeraz PB2 alt biriminin C-terminali (RWSN-PB2-Strep ³⁾ kadar olan kaynaşmıştr nitelendirdi. Bu rekombinant virüsler enfekte olmuş hücreler arası vRNPs dahil olmak üzere PB2-içeren kompleksleri, bir saflaştırma izin verir. VRNPs saflaştırılmış elde etmek için, enfekte hücre kültürleri ve vRNPs bu hücreler elde lizatları arındırılan afinitesi vardır edilir. Ancak, bugüne kadar kullanılan parçalama işlemleri genel bir nükleaz varlığına rağmen, çoğu zaman sadece verimsiz kromatin bağlı materyali çıkarmak, bir adım deterjan lizis dayalı olarak yapılmıştır.

Bizim ön çalışma nükleer vRNPs büyük bir kısmı geleneksel bir hücre parçalanması sırasında elde olmadığını düşündürmüştür ve bu nedenle afinite saflaştırılmış olamazdı. Bu ekstraksiyon verimini artırmak için, ve non-kromatin bağlı nükleer vRNPs gelen kromatin-bağlı ayırmak için, biz grip virüsü ile enfekte olmuş hücrelerde bir adım bilge Subselüler çıkarma protokolü uyarlanmıştır. Kısaca, bu prosedür ilk hücreden çekirdek ayırır ve daha sonra eriyen nükleer proteinler (burada "nucleoplasmic" fraksiyon olarak adlandırılır) ayıklar.Kalan çözünmeyen nükleer malzeme ardından Benzonase, iki tuz çıkarımı adımları takip belirsiz bir DNA / RNA nükleaz ile sindirilir: İlk 150 mM NaCl ("ch150" olarak adlandırılır) kullanılarak, daha sonra 500 mM NaCl ("ch500") (Şekil 1 ). Bu tuz ekstraksiyon adımları 500 mM NaCl henüz hala yakınlık matrisi tagged vRNPs bağlayıcı izin nükleer vRNPs% 85'inden çözünürleştirmek için yeterli olduğu konusunda bizim gözlemlerimize göre seçilmiştir.

Enfekte olmuş hücrelerin hücre içi fraksiyonasyon sonra, her bir fraksiyondan afinite purify PB2-etiketli vRNPs mümkündür ve protein ve sırasıyla, Western blot ve astar uzantısı, RNA kullanılarak analiz bileşenler. Son zamanlarda, 500 mM NaCl (ch500) ³ ile ekstrakte kromatin fraksiyonu üzerine enfeksiyon sonrası geç noktaları sırasında bu vRNP ihracat kompleksleri şeklinde keşfetmek için bu yöntem kullanılmıştır.

Protokol

Protokolünün şematik akış şeması Şek. 1 ve reaktifleri bir tablo aşağıda sunulmuştur.

1. Enfeksiyon (16 - 24 saat)

1. Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM)-yüksek bunlar ertesi gün (yaklaşık 5 x 10 hücre ⁸⁾ yaklaşık% 80 konfluent ulaşacak örneğin glikoz, orta, 5 mm 150 plastik hücre kültür tabaklarında HeLa hücreleri tohumu. Bu hücreler% 100 birbirine karışmış ulaşamamaktadır olması önemlidir.
2. Ertesi gün, içine Strep-etiketli grip virüsü stoku seyreltik fosfat-tamponlu salin (PBS) içeren% 0.3 bovin (BSA) 3 arasında bir enfeksiyon çokluğu için serum albümini.
3. Hücrelerinden büyüme medyumu kaldırmak, bir kez PBS ile yıkanır ve 10 ml PBS hücrelere virüs içeren ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile inkübe edilir.
4. DMEM-yüksek glukoz ile enfeksiyon orta değiştirin ve 37 inkübasyon devam ° C

"> Inkübasyon süresi (Tartışma bakınız) üzerinde çalışma yapılacak olan enfeksiyon faz bağlıdır.

2. Subselüler Fraksiyonu (3 saat)

1. Soğuk PBS ile bir defa yıkanır ve ardından hücreler bir lastik sıyırıcı ve 50 ml konik tüpe transferi ile soğuk PBS içerisinde askıya hücreleri.
2. 1000 rpm'de 5 dakika boyunca bir masa üstü santrifüj ile ve daha sonra pelet hücreler PBS aspire.
3. 10 ml soğuk sükroz tampon içinde Pastör pipetiyle hücre peleti (10 mM Hepes pH 7.9, 10 mM KCI, 2 mM Mg asetat (MgOAc), 3 mM _CaCl2, 340 mM sukroz, 1 mM ditiyotreitol (DTT),% 1 proteaz inhibitörü karışımı) . Süspansiyon sonra, hücre kümeleri bozmak için bir 10 ml plastik pipet serum takılı bir 200 ul pipet aracılığıyla hücrelere geçerler.
4. Buz üzerinde 10 dk inkübe edin. Yavaşça hücreleri tekrar süspansiyon periyodik ters.
5. 15 sn için yüksek hızda% 0.5 ve girdaplı bir son konsantrasyon elde etmek Nonidet P-40 (NP-40) eklenir. Derhal bir masa üstü centrifu içinde 4 ° C'de 3.500 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjge.
6. 4 at süpernatan ve mağaza çıkarın ° C Bu sitoplazmik bölümüdür. Pelet orijinal hücre peleti daha küçük ve daha beyaz olmalıdır. Bütün fraksiyonlar 4 ° C'de en az 4 saat boyunca saklanabilir
7. Adım 2,5 gibi 5 ml soğuk sükroz tampon, tekrar santrifüj ile pelet yıkanır ve süpernatant atılır.
8. 1.5 ml soğuk nucleoplasmic ekstraksiyon tamponu (50 mM Hepes pH 7.9, 150 mM KOAc, 1,5 mM _MgCl2,% 0.1 NP-40, 1 mM DTT,% 1 proteaz inhibitörü karışımı) içinde pelet (çekirdekler içeren) tekrar süspansiyon.
9. Bir dar havaneli ile soğutulmuş, tamamen cam 4 ml Dounce Homojenizatör transfer ve 20 vuruş ile çekirdekleri homojenize.
   Homojenizasyon sırasında köpük kaçının. Direnci yaklaşık 10 vuruş sonrası artırmalıdır. Verimli homojenleştirme bir faz kontrast mikroskop altında teyit edilebilir.
   
10. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü homojenize çekirdekleri aktarın ve 4 dönen bir tekerlek üzerinde 20 dk inkübe °C.
11. 10 dakika süre ile 4 ° C'de bir mikrosantrifüj içinde 16,000 x g'de santrifüje.
12. 4 at süpernatan ve mağaza çıkarın ° C Bu nucleoplasmic bölümüdür.
13. 1.5 ml sindirim tamponu (50 mM Hepes pH 7.9, 10 mM NaCl, 1.5 mM _MgCl2, 1 mM DTT,% 1 proteaz inhibitörü karışımı, 100 U / ml Benzonase (RNA analizi için, 20 U / ml RNase ile ikame in Pastör pipetiyle pelet içermeyen Dnaz i)) 37 ön ° C'a ısıtılmış ve 37 'de 10 dakika inkübe ° C.
14. 5 M NaCl 42 ul (150 mM NaCl nihai konsantrasyon) ekleyin ve 4 de 20 dakika daha inkübe ° C.
15. 10 dakika süre ile 4 ° C'de bir mikrosantrifüj içinde 16,000 x g'de santrifüje.
16. 4 at süpernatan ve mağaza çıkarın ° C Bu ch150 bölümüdür.
17. Pastör pipetiyle pelet 1.5 ml soğuk yüksek tuz tamponu (50 mM Hepes pH 7.9, 500 mM NaCI, 1.5 mM _MgCl2,% 0.1 NP-40, 1 mM DTT,% 1 proteaz inhibitörü karışımı) ve buz üstünde 20 dakika inkübe edilir.
18. 16.000 az x g / Em> 10 dakika süre ile 4 ° C'de bir mikrosantrifüj içerisinde.
19. 4 at süpernatan ve mağaza çıkarın ° C Bu ch500 bölümüdür.

3. Strep-etiket Arıtma (2 saat)

1. Sitoplazmik fraksiyon (150 mM NaCl nihai konsantrasyon) ile 5 M NaCl 300 ul ekleyin.
2. 15 ml konik tüp fraksiyon başına paketlenmiş Strep-Tactin Sepharose boncuk kısım 100 ul.
3. Karıştırmak ve bir masa üstü, 1.000 x g hızında 5 dakika santrifüj tüpü, invert boncuklara Strep yıkama tamponu ile 10 hacim (20 mM Hepes pH 7.9, 150 mM NaCl (ch500 numuneler için 500 mM NaCl), 1 mM EDTA) ekleyin santrifüj.
4. , Süpernatant atın iki kez adımı 3.3 tekrarlayın ve sonra Strep yıkama tamponu eşit hacmi boncuk pelletini.
5. Her bir fraksiyon (nuceloplasmic için 1.5 ml'lik tüplere mikrosantrifüj, ch150 ve ch500 fraksiyonlar ve sitoplazmik fraksiyon için bir 15 ml konik tüpe) ile yıkanmış, Strep-Tactin boncuk bulamacın 200 ul ekleyin.
6. Döndürmek4 at tüpleri 1s ° dönen bir tekerlek üzerinde C.
7. Tüpler 4 az 1000 x g'de 1 dk ° C'de santrifüje Süpernatant atın.
8. Her tüpe 1 ml soğuk Strep yıkama tamponu ekleyin. 15 ml tüp (sitoplazmik fraksiyonu) 1.5 ml tüp boncuk aktarın. 4 de, tüm tüpler 1 dk ° C, adım 3,7 gibi sonra santrifüj yıkanır. Iki kez bu yıkama işlemi tekrarlayın.
9. Son yıkama adımdan sonra, düz bir pipet kullanarak yıkama tamponu tüm izlerini silmek. 100 ul yıkama tamponu (Strep yıkama tamponu 2.5 mM desthiobiotin içeren) ekleyin ve hafifçe karıştırın.
10. Buz üzerinde 15 dk inkübe edin. Yavaşça tüplerin alt dokunarak bazen boncuk karıştırın.
11. Santrifüj tüpünde 4 az 1000 x g'de 1 dk ° C de mikrosantrifüj. Süpernatant içeren Yıkanan Strep-etiketli vRNPs toplayın.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Fraksiyonasyon etkinliğinin en antib kullanılarak parçalandı lizatlarının Western blot analizi ile karar verilirSubselüler belirteçler (Şekil 2) için belirli bir odies. Spesifik olarak, başarılı bir çekirdek içi fraksiyonasyon nucleoplasmic içinde çok az veya hiç hücresel RNA polimeraz II (Pol II), ya da çözünebilen Nükleer fraksiyonu ^4, ve en çok 150 mM NaCl ⁵ ile ekstre edilmelidir göstermelidir. Pol II'nin bir dejenerasyonu da tekrarlanabilir literatürde ⁶ ile tutarlıdır enfekte olmamış hücrelere, kıyasla influenza virüs ile enfekte olmuş hücrelerin içinde gözlenmiştir.

Şekil bir sitoplazmik eluat için gösterildiği gibi vRNPs saflaştırılması iyi, gümüş veya Coomassie boyama tarafından değerlendirilecektir. 3. Bizim deneyimlerimize göre, en Strep-PB2 tam şekillendirilmiş vRNP bir parçası olarak, yani biraz çözünür polimeraz yakalanır arınmışsa. Gümüş veya Coomassie boyama tarafından gözlemlenen PA/PB1/PB2 oranı: Bu yüksek NP yansır. Birkaç yerde RNases (örneğin, RNaz A gibi) dissosiyatif olarak böyle bir şekilde çatlatma viral RNA'nın bilinmektedir olarak daha düşük bir oran, RNases ile tampon kirlenme anlaşılacağıNP multimerleri ⁷ polimeraz yedik. İlginçtir, sadece Benzonase tedavisi, viral RNA sindirmek için yeterli iken, vRNP proteinlerin stokiyometrik oranları üzerinde hiçbir etkiye sahip olduğu görülmektedir. Bu fenomeni açıklamak değil de, biz bu Benzonase düşündüren diğer RNases (veriler gösterilmemiştir) ile sindirim sonrası vRNPs bozulması bazı önemli yapısal RNA bölgeleri bozulmadan bırakabilir gözlenmiştir. Sitoplazma ve nükleoplazmanın (nükleaz sindirim yapılmadan) gelen vRNPs saflaştırılması sonra, yüksek molekül ağırlıkları az 8 sönük ama farklı bantlar 8 grip genom segment tahmin molekül ağırlıkları karşılık gümüş boyama, (ref bakın. 3 ile takip edilebilir ).

9 saat, enfeksiyondan sonraki her fraksiyonda arındırılan vRNPs nispi miktarları Şekil 'de gösterilmiştir. 4. VRNPs dağılımı erken zaman noktalarında ch150 fraksiyonunda güçlü birikimi ile, enfeksiyon boyunca değişir veGeç zaman noktalarında nükleoplazmanın ve sitoplazma artmış birikimi.

Subselüler fraksiyonlama Şekil 1. Akış çizelgesi. Ref uyarlanmıştır. 3.

Şekil 2. Influenza virüsü ile enfekte hücrelerden Subselüler fraksiyonları Western blot analizi. 10 ⁹ HeLa hücrelerinde hücre içi fraksiyon önce 9 saat influenza virüs suşu WSN ile enfekte edildi. Toplam protein Eşit miktarlarda her kulvarın yüklenen ve gösterilen antikorlar kullanılarak analiz edildi. RNA polimeraz II (Pol II) C-terminal alanı (hypophosphorylated bandı en önemli olduğu), her türlü tanır klonu 8WG16 kullanılarak tespit edildi. Ref uyarlanmıştır. 3.

Şekil 3.VRNPs saf gümüş leke analizi. HeLa hücreleri RWSN (negatif kontrol olarak) veya sitoplazmik fraksiyondan Strep saflaştırma takiben 9 saat boyunca RWSN-PB2-Strep ile enfekte edilmiştir. Asterisk RNaz sindirim sonra görünmez bantları ifade eder. Ref uyarlanmıştır. 3.

Şekil 4. Farklı hücresel fraksiyonları arınmış vRNPs Gümüş leke analizi. 10 ⁹ HeLa hücrelerinde 9 RWSN PB2-Strep veya RWSN ile enfekte olan h Subselüler fraksiyon ve Strep arıtma izledi. Her fraksiyonu eluat Eşit miktarlarda yüklendi. Ref uyarlanmıştır. 3.

Tartışma

Birçok çalışmada son zamanlarda bireysel protein ya da grip virüsü enfeksiyonu ⁸ katılan hücresel ağları tespit ederken, bu etkileşimlerin çoğunluğunun fonksiyonel önemi belirsizdir. Grip virüsü RNA sentezi ve çekirdeğinde ⁹ karmaşık biofiziksel ve biyokimyasal doğaya kromatin bazlı fonksiyonların mutlak bağımlılığı göz önüne alındığında, yeni teknikler bu fonksiyonları aydınlatmak için gerekli olacaktır. VRNPs bir afinite saflaştırma ile birleştiğinde biz burada mevcut çekirdek içi fraksiyon, daha...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM-yüksek glukoz	Gibco	11965-092
BSA	Sigma	A9418
Proteaz inhibitörü Mix G	Serva	39101
Benzonase Nükleaz	Novagen	71206	25 U / ml
DNaz I, RNaz-free	ThermoScientific	EN0523	50 U / ml
Homojenizatör Dounce	Wheaton	432-1271	"B" havaneli yazın kullanın
Strep-Tactin Sepharose	IBA GmbH	2-1201-025	% 50 süspansiyon sütun biçiminde de kullanılabilir
Desthiobiotin	IBAGmbH	2-1000-002