Yöntem makalesi

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

DOI:

10.3791/4028

3 Haziran 2012

Bu makalede

Özet

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grip virüsleri konak hücre kromatin ile birlikte kendi RNA genomu çoğaltmak. Burada, enfekte olmuş hücrelerin kromatin gelen sağlam virüs ribonükleoprotein kompleksleri arındırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Viral kompleksleri Arıtılmış sırasıyla, Western blot ve protein ve RNA içerikleri astar uzantısı hem de analiz edilebilir.

Özet

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm negatif dallı RNA virüsleri gibi, influenza virüs genomu tek zincirli genom nükleoprotein (NP) tarafından kapsül içine, ve oluşan trimeric polimeraz kompleksi ile ilişkili olduğu viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNP), formunda paketlenmiş PA, PB1 ve PB2 alt birimlerinin. Bununla birlikte, çoğu RNA virüslerinin aksine, influenza virüs enfekte olmuş hücreler, çekirdeklerinde viral RNA'nın sentezi gerçekleştirmek. İlginçtir, viral mRNA sentezi primer olarak hücresel öncesi mRNA'ların kullanır ve bu süreç kromatin 1 gerçekleşir ileri sürülmektedir. Viral polimeraz ve konak RNA polimeraz II yanı sıra, NP ve ev sahibi arasındaki nükleozom arasındaki etkileşimlerin da 1,2 karakterize edilmiştir.

Yakın zamanda, bir tek Strep-Tag kodlayan rekombinant influenza virüsünün üretimi genetik olarak viral polimeraz PB2 alt biriminin C-terminali (RWSN-PB2-Strep 3) kadar olan kaynaşmıştr nitelendirdi. Bu rekombinant virüsler enfekte olmuş hücreler arası vRNPs dahil olmak üzere PB2-içeren kompleksleri, bir saflaştırma izin verir. VRNPs saflaştırılmış elde etmek için, enfekte hücre kültürleri ve vRNPs bu hücreler elde lizatları arındırılan afinitesi vardır edilir. Ancak, bugüne kadar kullanılan parçalama işlemleri genel bir nükleaz varlığına rağmen, çoğu zaman sadece verimsiz kromatin bağlı materyali çıkarmak, bir adım deterjan lizis dayalı olarak yapılmıştır.

Bizim ön çalışma nükleer vRNPs büyük bir kısmı geleneksel bir hücre parçalanması sırasında elde olmadığını düşündürmüştür ve bu nedenle afinite saflaştırılmış olamazdı. Bu ekstraksiyon verimini artırmak için, ve non-kromatin bağlı nükleer vRNPs gelen kromatin-bağlı ayırmak için, biz grip virüsü ile enfekte olmuş hücrelerde bir adım bilge Subselüler çıkarma protokolü uyarlanmıştır. Kısaca, bu prosedür ilk hücreden çekirdek ayırır ve daha sonra eriyen nükleer proteinler (burada "nucleoplasmic" fraksiyon olarak adlandırılır) ayıklar.Kalan çözünmeyen nükleer malzeme ardından Benzonase, iki tuz çıkarımı adımları takip belirsiz bir DNA / RNA nükleaz ile sindirilir: İlk 150 mM NaCl ("ch150" olarak adlandırılır) kullanılarak, daha sonra 500 mM NaCl ("ch500") (Şekil 1 ). Bu tuz ekstraksiyon adımları 500 mM NaCl henüz hala yakınlık matrisi tagged vRNPs bağlayıcı izin nükleer vRNPs% 85'inden çözünürleştirmek için yeterli olduğu konusunda bizim gözlemlerimize göre seçilmiştir.

Enfekte olmuş hücrelerin hücre içi fraksiyonasyon sonra, her bir fraksiyondan afinite purify PB2-etiketli vRNPs mümkündür ve protein ve sırasıyla, Western blot ve astar uzantısı, RNA kullanılarak analiz bileşenler. Son zamanlarda, 500 mM NaCl (ch500) 3 ile ekstrakte kromatin fraksiyonu üzerine enfeksiyon sonrası geç noktaları sırasında bu vRNP ihracat kompleksleri şeklinde keşfetmek için bu yöntem kullanılmıştır.

Protokol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolünün şematik akış şeması Şek. 1 ve reaktifleri bir tablo aşağıda sunulmuştur.

1. Enfeksiyon (16 - 24 saat)

  1. Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM)-yüksek bunlar ertesi gün (yaklaşık 5 x 10 hücre 8) yaklaşık% 80 konfluent ulaşacak örneğin glikoz, orta, 5 mm 150 plastik hücre kültür tabaklarında HeLa hücreleri tohumu. Bu hücreler% 100 birbirine karışmış ulaşamamaktadır olması önemlidir.
  2. Ertesi gün, içine Strep-etiketli grip virüsü stoku seyreltik fosfat-tamponlu salin (PBS) içeren% 0.3 bovin (BSA) 3 arasında bir enfeksiyon çokluğu için serum albümini.
  3. Hücrelerinden bü....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok çalışmada son zamanlarda bireysel protein ya da grip virüsü enfeksiyonu 8 katılan hücresel ağları tespit ederken, bu etkileşimlerin çoğunluğunun fonksiyonel önemi belirsizdir. Grip virüsü RNA sentezi ve çekirdeğinde 9 karmaşık biofiziksel ve biyokimyasal doğaya kromatin bazlı fonksiyonların mutlak bağımlılığı göz önüne alındığında, yeni teknikler bu fonksiyonları aydınlatmak için gerekli olacaktır. VRNPs bir afinite saflaştırma ile birleştiğinde biz burada mevcut çekirdek içi fraksiyon, daha.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar RWSN PB2-Strep virüs için Nada Naffakh ve Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) teşekkür etmek istiyorum.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
DMEM-yüksek glukoz Gibco 11965-092
BSA Sigma A9418
Proteaz inhibitörü Mix G Serva 39101
Benzonase Nükleaz Novagen 71206 25 U / ml
DNaz I, RNaz-free ThermoScientific EN0523 50 U / ml
Homojenizatör Dounce Wheaton 432-1271 "B" havaneli yazın kullanın
Strep-Tactin Sepharose IBA GmbH 2-1201-025 % 50 süspansiyon sütun biçiminde de kullanılabilir
Desthiobiotin IBAGmbH 2-1000-002

Kaynaklar

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
  2. Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Viral RNA SynthesisChromatin FractionationSubcellular FractionationBenzonase DigestionSalt ExtractionWestern Blot AnalysisPrimer Extension AssayStrep Tag Purification

İlgili makaleler