Yöntem makalesi

Incelenmesi için İnsan Fallop Tüp Modeli

15.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/4036

⸱

11 Ağustos 2012

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

Bu makalede

Özet

Biz bir tarif Ex vivo enfeksiyon modeli. Tüm organ doku modeli araştırmak için kuruldu C. trachomatis bağlı patoloji.

Özet

Chlamydia trachomatis ile genital sistem enfeksiyonları (C. trachomatis) tüm dünyada kadınlarda en sık görülen cinsel yolla bulaşan hastalık vardır. Patojenlerin Verimsiz klirensi veya kalıcılık üst genital sistem enfeksiyonları artan ve enfekte dokuların 1,2 kronik inflamatuar zarar gerekiyordu yol açabilir. Sonuç olarak, pelvik inflamatuar hastalık (PID), tubal oklüzyon ve infertilite gibi ciddi klinik sekeller 3,4 oluşabilir.

C ile araştırmaların çoğu trachomatis epitel hücre çizgilerinden (örneğin HEp-2 hücreleri ve HeLa-229) veya farelerde yapılmıştır. Bununla birlikte, hücre kültürü bazlı modelleri ile olduğu gibi, ne de ana doku fizyolojisini ya da C'nin patofizyolojisini yansıtır yok in vivo 5 trachomatis genital sistem enfeksiyonları. Başka sınırlamalar gerçeği ile verilir, merkez sinyal şelaleri (ör. IFN-γ mediatintrasellüler klamidyal büyümesini kontrol ed JAK / STAT sinyal yolağı) temelde farelerde ve insanlarda 6,7 arasında farklılık. Biz ve diğerleri, bu nedenle C arasında doğrudan etkileşimleri araştırmak için bütün bir organın fallop tüpü model oluşturdu trachomatis ve insan fallop tüpü hücrelerinin ex vivo 8,9.

Bu amaçla, histerektomi geçiren kadınlarda insan fallop tüpleri C ile toplanır ve enfekte edildi 24 saat sonrası enfeksiyon içinde trachomatis serovar D., örnek nerede Chlamydia trachomatis algılamak için taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak epitel hasarı gibi aracılık analiz C. Fallop dokusunda trachomatis dahil oluşumu.

Protokol

1. Chlamydia trachomatis serovar D Stok hazırlanması

  1. 4 ml C. ile HeLa-229 hücre içeren konfluent 175 cm 2 hücre kültürü şişesi Infect tampon SPG içinde trachomatis D.
  2. Sürekli sarsıntı sırasında 37 ° C'de bir saat inkübe edin.
  3. % 10 FCS ve 240 ul Cycloheximide ile 20 ml DMEM ekleyin.
  4. 37 de 48 saat süre ile nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe ° C'de ve% 5 CO2.
  5. C. ayırmak ve yok etmek için 5 ml steril cam boncuk, güçlü sarsıntı ekle HeLa-229 hücreleri barındıran trachomatis.
  6. Süpernatant toplayın ve steril cam boncuk başka bir 5 ml ekleyin.
  7. 1 dakika Kaya üç kez tüm HeLa-229 hücrelerini yok ve serbest C'ye trachomatis.
  8. 5 1000 RPMI dk ve 4 santrifüjleyin ° C hücresel enkaz kurtulmak için.
  9. 8-10 175 cm 2 hücre kültürü enfeksiyonu için supernatant toplamak konfluent g şişelerHeLa 229 hücrelerle rown.
  10. 37 az bir saat için 4 ml SPG tampon ve önceki enfeksiyondan 4 ml supernatant ° sürekli sarsıntı ile C hastası olan her şişesi inkübe edin.
  11. Bir saat% 10 FCS ile 37 ° C ve% 5 CO2 az 48 saatlik inkübasyondan ardından 230 ul sikloheksimid ile 15 ml DMEM ekledikten sonra.
  12. , 5 ml steril cam boncuk ekle ayırmak için sallayın ve C. yok HeLa-229 hücreleri barındıran trachomatis.
  13. Süpernatant toplayın ve steril cam boncuk başka bir 5 ml ekleyin.
  14. 1 dakika Kaya üç kez tüm HeLa-229 hücrelerini yok ve serbest C'ye trachomatis.
  15. 4 1000 RPMI az 5 dakika boyunca santrifüj ° C hücresel enkaz kurtulmak için.
  16. Süpernatant toplayın.
  17. 11000 RPMI ile 99 dakika boyunca 50 ml Falcon tüpleri, santrifüj süpernatant 40 ml doldurun.
  18. Santrifüj sonra süpernatan atmak ve 1 ml tampon SPG ile pelet yıkayın.
  19. Homojenizepelet -70 az 1, 5 ml Eppendorf tüp, mağaza ° C'de kullanılıncaya kadar 1 ml SPG ve tablet 20 ul içinde. Hazırlanan stok biyolojik aktivite kurulu bir HeLa-229 hücre enfeksiyon modelinde doğrulandı.

2. İnsan Fallop Tüp hazırlanması

  1. Hemen RPMI hazırlık kadar 4 antibiyotik olmadan ° C% 5 FCS içeren cerrahi sonrası histerektomi geçiren kadınlarda Store'dan insan fallop tüpleri (HFT). Protokolü Lübeck Üniversitesi (09-153) etik komitesi tarafından onaylandı. (53 yaşına kadar 34) çalışmaya dahil Kadınlar önceden C. öyküsü yoktu trachomatis enfeksiyonu. Fallop tüplerinin Doku sezaryen sırasında veya luteal faz semptomatik miyom nedeniyle histerektomi sırasında annenin isteği üzerine peripartum sterilizasyon toplanmıştır. Tüm HFT C. için negatif test edildi PCR ile trachomatis.
  2. RPMI içeren Petri içinde HFT teşrihAntibiyotikler olmadan% 5 FCS. Bütün işleme sırasında doku kurumasını önlemek için ortam içine daldırılmış edilmelidir.
  3. Kesiniz ve ameliyat sırasında tahrip bağ dokusu ve doku atın.
  4. Diseksiyon sonra küçük bir bistüri ile dikkatlice HFT açın.
  5. Daha ayrıntılı bilgi için deneyler x 0,5 cm yukarı 1 cm x 1 cm ile 0.5 cm büyüklüğünde doku parçalarını hazırlamak.
  6. Enfeksiyon mağaza HFT numune için 1 ml RPMI antibiyotikler olmadan% 5 FCS içeren. HFT örneklerinin C. 5.5x10 5 IFU (dahil oluşturan birim) ile enfekte olduğunu trachomatis.
  7. 37 içinde HFT numunesi inkübe ° C,% 5 CO2 ve% 21 O2 gibi 37 ° C,% 5 CO2 ve 2 saat süre ile% 24 O2.
  8. İnkübasyon süresi 4 en az üç gün Monti en sabitleştirici olarak örnek ve mağaza toplamak sonra SEM / TEM hazırlık kadar ° C.

3. TEM için HFT Numune Hazırlanması

  1. IçinTEM Monti en sabitleştirici gelen örnek kaldırmak ve 4 x 5 mm adet 2 x 2 mm kesti. Geriye kalan doku SEM için kullanılabilir.
  2. 1 saat süreyle sodyum cacodylate tamponu, pH 7.35 ile parçalara yıkanır.
  3. % 1 (w / v) su içinde hedef osmiyum tetroksit de inkübe. gecede.
  4. Sodyum cacodylate tamponu, pH 7.35 olarak 6x5 dakika yıkanması ile aşırı osmiyum tetroksit çıkarın.
  5. Su içinde etanol artan yoğunluklarda (v / v) (2 saat süreyle% 30, 2 saat süreyle% 40, 2 saat süreyle% 50, 2 saat süreyle 60%, gece boyunca 70%, 2 için 80% in kuluçkaya suyu uzaklaştırmak s, 1 saat boyunca 90%, 1 saat boyunca 95%, 1 saat boyunca 100%.
  6. Propilen oksit in 2 x 15 dakika boyunca etanol dışarı yıkanır ve daha sonra% 50 oranında bir karışımı (v / v) içinde propilen taze hazırlanmış araldit (tüm bileşenler de dahil olmak üzere) aktarmak ve bir gece boyunca inkübe edilir.
  7. En az 1 saat için taze hazırlanmış araldit (tüm bileşenler de dahil olmak üzere) transfer edilir.
  8. Düz gömme kalıpları transfer ve araldit ile doldurun.
  9. Için araldit sertleştiriniz60 ° C'de en az 48 saat
  10. Gömülü örnek Kesimden sonra cam bıçak veya histo elmas bıçak kullanılarak bir ultramicrotome üzerine yarı ince kesitler (700 nm) kesilmiş ve Richardson ile leke leke.
  11. Bir elmas bıçak ve bakır ızgaralar (örneğin 150 kare gözlü) transfer kullanan ultra-ince kesitler (yaklaşık 70 nm) kesin.
  12. Aqua dest% 0.5 (w / v) uranil asetat ile ultra-ince kesitler Leke. % 3 (w / v) su hedef kurşun sitrat izledi. otomatik bir bölümü yapıcısı içinde. Alternatif olarak, bölüm ızgaraları su hedef olarak uranil asetat ile doymuş bir çözelti santrifüje üzerinde 15 dakika bırakarak elle boyanmış edilebilir. su hedef olarak% 0.3 kurşun sitrat (w / v) izledi.

4. SEM için HFT numune hazırlanması

  1. SEM epitel 1.5 x 1 cm mantar levha üzerinde yukarı bakacak şekilde Monti en fiksatörü, orient örnek kaldırmak ve böcek iğneleri kullanarak konumunu düzeltmek için.
  2. Uygun metal sepet mantar üzerinde örnek aktarın vesodyum cacodylate tamponu, pH 7.35 olarak 30 dakika süre ile yıkanır.
  3. Aseton / su karışımları artan konsantrasyonları (v / v) 6 saat süreyle% 30, 6 saat süre ile% 40, 8 saat boyunca 60%, gece boyunca 70%, 2 saat süreyle% 80,% 90 oranında içinde Örnek kuluçkaya suyu uzaklaştırmak Gece boyunca 2 saat ve% 100 (numune sürekli su altında tutmak son derece dikkatli olmalı).
  4. Kritik nokta kurutma (sıcaklık 40 ° C, basıncı 80 bar) tarafından taze% 100 aseton ve kuru numune transfer.
  5. Iletken karbon çimento kullanarak bir iletken karbon sekmesi ile donatılmış SEM numune montaj bakacak şekilde epitel ile iğne, mantar ve tutkal örnek çıkarın. Montaj ve iletken karbon sekmesini arasındaki iletkenliği artırmak için sıvı iletken gümüş kullanın.
  6. Bir lak sputter kullanılan numunenin iletken bir platin, altın veya paladyum kaplama hazırlayın.

5.. Richardson'ın Leke Yarı İnce Kesitler boyanması

  1. Slaytta yarı ince kesitler kurumasını bekleyin.
  2. 1-2 dakika süreyle 60 ° C sıcaklıkta çözelti boyama ile bölümlere leke.
  3. Aqua dest yıkayın.
  4. Kuru bölümleri ve kapak.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Insan fallop tüpü enfeksiyonu modeli içinde biz enfekte olmayan kontroller (Şekil 1) ve C arasında epitelyal morfoloji farklılıklar görselleştirmek başardık trachomatis - normoksik koşul altında enfekte tüpleri (Şekil 2). Karakteristik morfolojik farklılıklar enfekte olmayan kontroller tespit edilemedi fallop tüpü epitel hücrelerinin patojen bağlı şişme ve lizis ima etti. Yarı ince kesit ve transmisyon elektron mikroskobu kullanarak bizim hücre içi C ispat başardık insan fallop tüpü doku enfekte ex vivo trachomatis dahil oluşumu (Şekil 3, 5) ancak enfekte olmayan kontrollerde (Şekil 4). Oksijen konsantrasyonu gibikadın genital yollarında ASIZ biz de hipoksik koşullarda bizim modeli incelenmiştir inflamatuar sürecinde fizyolojik koşullarda 11 ve daha fazla azalma altında zaten düşük. Ön sonuçlar modeli oksijen biyokatalist altında klamidyal büyüme ve döl analiz etmek yararlı olduğunu göstermektedir. Chlamydia-indüklenen epitel hücre hasarına enfeksiyonu önce fallop tüpleri (Şekil 6) dikkatsizce kullanımı ve kullanım aracılığı ile ortaya eserler ayrılması gerekir.

figure-protocol-1
Şekil 1. Kontrolü ortamda bir gün inkübasyon (yeşil ok silli hücre, mavi ok olmayan silli hücre hepsini göster) sonra enfekte olmayan insan fallop elektron mikroskobu (SEM).

figure-protocol-2
Şekil 2. Tarama elektron mikro insan fallop tüpü bir gün sonrası enfeksiyon (beyaz ok işareti rüptüre dahil) enfekte bir ex vivo C. trachomatis kopyası (SEM).

figure-protocol-3
Şekil 3. Yarı ince kesitler C ile insan tuba enfeksiyondan sonra tipik intraselüler inklüzyon (beyaz oklar) 1d göstermek trachomatis ex vivo.

figure-protocol-4
Şekil 4. Kontrolü ortamda bir gün inkübasyondan sonra non-enfekte insan tuba transmisyon elektron mikroskobu (TEM).

figure-protocol-5
Bir ex vivo C. Şekil 5. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) trachomatis insan fallop tüpü bir gün sonrası enfeksiyon (beyaz oklar klamidyal kapanım işaretleyin) bulaşmış.

ve_content "> figure-protocol-6
Şekil 6. Numunenin dikkatsizce hazırlama ve işleme (beyaz ok işareti epitel doku tahrip) yoluyla zarar fallop tüpü epitelin elektron mikroskobu (SEM).

Tartışma

Enfekte dokuya patojen ile endüklenen zarar görselleştirme zahmetli ve farelerde deney prosedürleri genellikle sınırlı değildir. Biz C. analiz etmek, insan fallop tüpleri bir ex vivo enfeksiyon modelinde kurulan Üst kadın genital sistem enfeksiyonları trachomatis. Bu metodun kullanılması suretiyle, C. görsel mümkün olduğu trachomatis - bir gün sonrası enfeksiyon içinde insan fallop tüpü epitel hasarını. Hücresel şişme ve lizis C. gözlendi tipik morfolojik değişiklikler vardı trachomatis - enfekte fallop tüpleri ancak enfekte olmayan kontrol. TEM analizleri klamidyalar yeniden farklılaşmış temel organları değil, aynı zamanda kalıcılık gösterebilir genişlemiş retiküler organları ile küçük inklüzyonlar büyük inklüzyonları gösteren, enfekte dokuların içinde tipik bir hücre içi gelişim döngüsünü gerçekleştirirken ortaya koymuştur. Ancak tek başına morfolojik resmi repl arasında ayrım yeterli değilazalmış metabolizma ile karakterize edilir ve icating ve inatçı enfeksiyonlar, antibiyotik 10 dayanıklılığı artar.

Enfekte fallop tüpleri epitel tahribatı C. bozulması için iki nedeni trachomatis - hücre içi gelişim döngüsü ve enfeksiyöz elementer cisimlerin serbest bırakılması veya pro-inflamatuvar 8 sürümü tamamlanmasından sonra enfekte olmuş epitel hücreleri. Patojen bağlı doku hasarı ve C'ye karşı konak bağlı immün reaksiyonlar trachomatis epitel hücre fonksiyonu, fibroblast şekillenmesi ve in vivo 8,11 nihayet tubal kaybına yol açan başlıca faktörler olması gerekiyordu.

Bu model önemli kısıtlamaları biri başlangıç ​​C. sekonder etkileri analizi engellemektedir inflamatuar hücrelerin yokluğudur Fallop tüpü epitel trachomatis enfeksiyonu. Bununla birlikte, modeli ap olduğufarklı çevresel koşullarda (örneğin oksijen içeriği) ve akut C. ilk ana-immün yanıtı araştırmak için propriate trachomatis enfeksiyonları 8,9. Daha planları C'ye karşı antibiyotik test için bir model oluşturmaktır Tüm insan fallop tüpleri ve 2-foton lazer tarama mikroskop ile tuba epiteli gözlenen farklı gelişim aşamalarında metabolik durumları karakterize etmek trachomatis.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu çalışma "Interfaces inflamasyon" Mükemmeliyet DFG-Küme (RA-Eğer, RA-D) tarafından desteklenmiştir. Biz Kristin Wischnat mükemmel teknik destek için minnettarız.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
DMEM PAA E15-843
RPMI PAA R15-802
FCS PAA A15-101
Cycloheximide Sigma - Aldrich
Tampon SPG çeşitli aşağıdaki tarife bakınız
Monti en fiksatif çeşitli aşağıdaki tarife bakınız
sodyum cacodylate tampon çeşitli aşağıdaki tarife bakınız
Richardson en leke çeşitli aşağıdaki tarife bakınız

Tarifler:

1. Tampon SPG

  1. 75 g sakaroz ekleyin.
  2. 2.47 g disodyum fosfat ekleyin.
  3. 0.36 g monosodyum fosfat ekleyin.
  4. 0.72 g glutamik asit ekleme.
  5. Aqua dest ile 1 l doldurun.
  6. 7.3 pH ayarlayın.

2. 0.1 M sodyum cacodylate tamponu, pH 7.35.

  1. 42.80 g dimethylarsenic asit sodyum tuzu ekleyin.
  2. 68.46 g sakaroz ekleyin.
  3. Aqua dest ile 1 l doldurun. 0.2 M sodyum cacodylate tamponu almak için.
  4. Aqua dest ile çözelti kullanmadan önce. istenen konsantrasyonu ve 7,35 gerekirse üzere pH'ı ayarlamak için.

3. Monti en fiksatif

  1. 156 ml 0,12 M sodyum cacodylate tamponunu ekleyin. 3,2 su hedef olarak 25 mL% 25 Glutaraldehit ekleyin.
  2. 19 ml ekleAqua dest% 10 paraformaldehit.
  3. Aqua dest 3 ml% 3 CaCI2 ekleyin.
  4. 7,35 pH ayarlayın ve aqua dest ile doldurun. 312 ml nihai bir çözüm için.

4. Richardson'ın leke

  1. Aqua dest% 1 sulu boraks çözeltisi ve% 1 Azur II% 1 metilen mavisi eşit hacimde karıştırılır.

Kaynaklar

  1. Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping. J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).
  2. Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility. Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).
  3. Peipert, J. F. Clinical practice. Genital chlamydial infections. N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).
  4. Mardh, P. A. Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).
  5. Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells. Mol. Cancer. 5, 55(2006).
  6. Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells. Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).
  7. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
  8. Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection. Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).
  9. Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).
  10. Wyrick, P. B., Knight, S. T. Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin. J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).
  11. Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring. Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Chlamydia trachomatisTaramal Elektron MikroskobuGe irimli Elektron MikroskobuEx Vivo Doku ModeliMonty SabitleyicisiKritik Nokta KurutucuSputter Kaplay cUltra MikrotomHipoksi Odas

İlgili makaleler