Yöntem makalesi

Tek hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip supratreshold nöral aktivitenin Optik kaydı

DOI:

10.3791/4052

⸱

5 Eylül 2012

 , 
1Section of Neurobiology, Center for Learning and Memory, The University of Texas at Austin

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kortikal nöronlarda işlev popülasyonlarının düzeyinde ortaya çıkar, çünkü omurgalı merkezi sinir sisteminin fonksiyon anlama çok nöronların kayıtları gerektirir. Burada tek hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip supratreshold nöral aktiviteyi kaydetmek için bir optik yöntem tarif, rasgele erişim tarama titrek. Kadar yüksek zamansal çözünürlüğe sahip 100 nöronlara Bu yöntem kayıtları somatik flüoresan kalsiyum sinyalleri. Maksimum-olabilirlik algoritması somatik flüoresan kalsiyum sinyallerinden yatan supratreshold nöral aktivitenin deconvolves. Bu yöntem, güvenilir, yüksek algılama verimliliği ve yanlış pozitif düşük bir oranı ile sivri algılar ve nöral popülasyonlar incelemek için kullanılabilir In vitro Ve In vivo.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omurgalı merkezi sinir sisteminde bilgi sinyal genellikle nöronlar ziyade tek nöron popülasyonları tarafından taşınır. Ayrıca supratreshold çivileme aktivite yayılımı nöron popülasyonları içerir. Kortikal fonksiyon adresleme ampirik çalışmalar doğrudan böylece yüksek çözünürlüklü nöron popülasyonları kayıtları gerektirir. Burada optik bir yöntem ve tek-hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip 100 nöronlara gelen nöral aktiviteyi kaydetmek için bir ters evrişim algoritma tanımladık. Bu yöntem kortikal nöronlarda supratreshold elektrik sivri (aksiyon potansiyeli) ile ilişkili intraselüler somatik kalsiyum konsantrasyonunu geçici artışlar saptanması temeline dayanır. Optik kayıt yüksek zamansal çözünürlük akusto-optik deflektörler (AODs) 1 kullanarak hızlı bir rasgele erişimli tarama tekniği ile elde edilir. Opak beyin tis yüksek uzaysal çözünürlükte kalsiyum duyarlı boya sonuçları iki-foton uyarma2 dava. Flüoresan kalsiyum kayıtlarından sivri rekonstrüksiyonu, bir maksimum olabilirlik yöntemden biri ile elde edilmektedir. Eşzamanlı elektrofizyolojik ve optik kayıtlar bizim yöntem güvenilir kramponları (>% 97 başak algılama verimliliği) algılar olduğunu gösterir, yanlış pozitif başak algılama (<0.003 kramponları / s) ve yüksek temporal hassasiyetli (ms yaklaşık 3) 3 düşük bir orana sahiptir. Başak tespit optik Bu yöntem, in vitro ve in vivo 3,4 anestezi uygulanmış hayvanlarda sinirsel aktiviteyi kaydetmek için kullanılabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Optik kurulumu (Şekil 1)

  1. Iki foton uyarma için femtosaniye darbeler ile kızılötesi darbeli lazer sistemi kullanılmaktadır. Yüksek bir lazer gücü (> 2W 890 nm dalga boyunda bazı durumlarda), sistemin optik bileşenleri tarafından sunulan büyük kayıplar telafi etmek için gereklidir.
  2. İki prizmalar oluşan prechirper sistemi AODs 1 tarafından tanıtıldı zamansal dağılımını telafi önce acousto-optik deflektörleri (AODs) için lazer darbeleri üzerine olumsuz bir grup hızı dispersiyonu (GVD) verir.
  3. Büyük delikler İki AODs (NA 0,8 ile 40x suya daldırma hedefi için 10 mm) iki boyutlu lazer ışını sapabilir.
  4. 100 bahçeleri / mm olan bir yansıtıcı kırınım kısa lazer darbeleri kullanırken AODs arkasında 13 cm AODs tarafından tanıtıldı mekansal dağılımını dengelemek için yerleştirilir.
  5. Lazer ışını dik microsco ve kamera bağlantı noktasına iki röle teleskoplar ile yönlendirilirpe.
  6. Süsenler optik bileşenlerin uyum için düzenli aralıklarla yerleştirilir.
  7. Objektif önünde bir dikroik ışın ayıracı numune kızılötesi uyarma ışığı iletir ve bir detektör üzerinde örneğinden floresan ışığı yansıtır.
  8. Epi-ve transfluorescence dedektörler (fotoçoğaltıcılar, Proje Yönetim Ekipleri) amacı ile floresans sinyal toplamak ve - varsa - kondenser ile.
  9. Renkli cam filtreleri (BG-39, 3-5 mm) dedektörleri ulaşan ikaz ışığı engellemek için dedektör önüne yerleştirilmiş.
  10. AOD sapma açılarına da gerilim kontrollü osilatörler sürücüler dijital-analog çevirici kartı (156.25 kHz saat hızı) ile donatılmış bir bilgisayar tarafından kontrol edilir.
  11. Fotoçoğaltıcılar gelen sinyal saklanmadan önce bir alçak geçiren Butterworth filtre (100 kHz kesme frekansı) vasıtasıyla döşenen ve bir analog-dijital çevirici (156.25 kHz saat hızı) tarafından sayısallaştırılıranalizi için bir bilgisayar.
  12. Hizalama ve elektriksel gürültünün yanı sıra ile ve gösterge olmadan, fotoçoğaltıcılar düşük ve yüksek kazanç, lazer ışığı ile ve olmadan floresan sinyalleri dağıtım kayıt ile test edilir. Tarayıcının düzgün ayarlamak ve yüksek bir kazanç ve gösterge ile floresan sinyalleri dağıtım genişlik floresan sinyalleri başka dağılımlar (Şek. 2) genişliklerine daha büyük olduğu zaman korumalıdır.

2. Deneysel prosedürler

  1. Dithered rasgele erişim taraması kalsiyum intrasellüler kalsiyum artışını tespit dayanır. Nöronların çok sayıda sinir dokusu içine 5 bir kalsiyum göstergesinin ester formu (örneğin Oregon Green 488 Bapta-01:00) bolus enjeksiyonu ile lekeli olabilir.
  2. Her nöron soma gelen çeşitli konumlarda ("taklidi", 4 yerle her konum için 6.4 μs e = 25,6 μs kayıt süresi, kısa bir süre için her kaydedilirHer döngüde ach nöron, Şek. 3C). Ilgi nöronlar seçmek için 256x256 piksel oluşan bir full frame (Şekil 3A) elde edilir. Kaydedilecek her nöron soma merkezi bu resmin içinde manuel olarak seçilir. Kontrol yazılımı otomatik olarak bu merkez etrafında 2 mikron mesafe üç puan ekler.
  3. Her döngü içerisinde, flüoresan sinyali 40 nöronlar (Şekil 3B) her birinden kaydedilir. Bu işlem bir kayıt (5 saniyelik kayıt = 3255 devir, 1 devir = 1.536 ms) süresi boyunca tekrarlanır.

3. Başak algılama verimliliği maksimize etmek için online yazılım araçları

  1. Floresans somatik kalsiyum sinyallerinden Spike algılama somatik flüoresan kalsiyum sinyalleri yüksek bir sinyal-gürültü (S / N) oranı dayanır. S / N yüksek bir yoğunluk uyarma artırılması ile elde edilebilir. Uyarma yoğunluk, ancak, sadece, çünkü fotohasar belirli bir sınıra kadar arttırılabilir. Spike algılama çok küçük bir windo içinde yüksekfloresans sinyalleri yüksek bir S / N ama var uyarma yoğunlukları w sadece burada sadece çok az fotohasar 3. görülmektedir. Kaydedilen sinyaller biz foton oranı (Denklem 3.2) ve çevrimiçi analizi ile bazal floresans azalması izlemek kayıtları sırasında yüksek başak algılama pencere içinde olduğundan emin olmak için.
  2. Nöron başına yaklaşık foton hızı bazal gürültü kısa bir süre pencerede (100-200 ms) hesaplanır. Foton sayısı (N λ) ve foton oranı (λ = N λ / Dt) aşağıdaki denklem ile göreceli floresan değişikliklerin dağılımı (σ) takılması ile floresan değerleri kullanılarak hesaplanmaktadır:

figure-protocol-1
Bu eşitlik nisbi floresans değişikliği değişken değişimi ile foton atış gürültü için poisson dağılım gösterir: hızındaki / F = (G * K λ (t)-G * N & lambda;, 0) / G * N λ G fotoçoğaltıcı kümülatif kazanç ve diğer tüm elektronik bileşenleri ifade eder 0. Foton atış gürültü ek olarak diğer gürültü kaynaklarının (hareket eserler) vardır, çünkü bu denklem doğru vivo kayıtları için saptanan fotonların sayısını belirlemek unutmayın. Bununla birlikte, bu denklem gürültü tahmin etmek için in vivo olarak kayıt için yararlıdır.

  1. Baz floresan aynı zamanda pencere hesaplanır ve zaman ya da denemeler bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Bazal ortalama düşüş bu sınırın aşılması durumunda başak algılama hızla düşmektedir çünkü lazer güç ayarlayarak 0.0002 / s altında tutulur.
  2. Nöron somata pozisyonları her 10-20 dk Yeniden full frame bir görüntü elde edilerek doğrulanır. Gerekirse, kayıt yerle ayarlanır. Mekanlar kerede veya bireysel nöronlar için bütün nöronlar için ayarlanabilir.

4. Reconstruction floresan sinyalleri (ters evrişim) den başak zamanlamaları

  1. Kalsiyum Transientlerin çürümesi uzun zaman çünkü genellikle summate sinirsel aktivite sonucu floresans sinyalleri (birkaç yüz milisaniye). Bir metoduyla floresans sinyallerine başak ve başak zamanlamaları yeniden yapılandırır.
  2. Kaydedilen floresans sinyali yatan en olası başak tren belirlemek için farklı modeller karşılaştırılmıştır. Burada modelini belirlemek için bir genetik algoritma kullanılan - ve başak tren ve başak zamanlamaları dolayısıyla - maksimum olabilirlik ile.
  3. Nöronların homojen olmayan toplumlarda, başak-uyarılmış kalsiyum sinyali nöronların arasında değişebilir. Verilerin analizi denetimsiz ayarlar için biz dikkate nöron nöron için başak-uyarılmış kalsiyum sinyal değişimi alır bir algoritma tasarlanmıştır.
  4. Yanlış pozitif bulgulama çok sayıda önlemek için, o m sabit izin genlik ve sönüm süresine kısıtlamak için yararlıdırbaşak-uyarılmış kalsiyum sinyal odel. Tek başak uyarılmış kalsiyum Transientlerin sabit genlik ve yıkım zamanı ortak dağılım eşzamanlı elektrofizyolojik ve optik kayıtlar kullanarak aynı deneysel koşullarda nöronların aynı tip deney kümesinin ayrı kaydedilir.
  5. Yavaş baz değişiklikleri dikkate almak için ve deconvolving hesaplama maliyetlerini azaltmak için, daha uzun kayıt 1-5 saniyede birkaç kısa izleri ayrılır.
  6. Her bir nöron ve her kayıt için, ters evrişim algoritması modeller çok sayıda (kadar 1,000,000 modelleri ya da daha fazla) test edebilir. Ters evrişim hızlandırmak için, bir deneme paralel 10 farklı bilgisayarlara kadar deconvolved edilir.
  7. Ters evrişim sonra, başak verileri analiz ve kontrol edilir. Bir peri-uyarıcı zamanlı bir histogram, başak olasılık ve atış hızı (nöronlar başına ortalama başak) otomatik bir şekilde hesaplanır.

5.Temsilcisi Sonuçlar

Kaydedilen floresans somatik kalsiyum sinyalleri yüksek bir sinyal-gürültü oranına Başarılı başak algılama menteşeleri. Sadece yüksek uyarma oranları (yüksek lazer gücü) kullanılarak biyolojik materyal (fotoyaşlanma) üzerine photoeffects bir olumsuz etkiye neden olabilir. Titretilmiş rasgele erişim tarama fotohasar olarak bazal floresans düşüşler olarak tezahür eder ve başak-uyarılmış kalsiyum floresans sinyalleri azaltır. Başak-uyarılmış sinyal içinde hızlı bir şekilde azalma ani tespit etmek için bir arızaya yol açabilir. Floresan sinyalleri başak tespit yüksek uyarım yoğunluğu sadece çok küçük bir pencere bulunmaktadır. Yüksek ucunda bu pencerenin alt ucunda flöresan sinyalleri düşük bir sinyal-gürültü oranı, fotohasar ile sınırlıdır. Akut dilimler halinde kortikal nöronlar için biz dilim yüzeyinin altında yaklaşık 100 mikron az kaydederken 400,000-1,500,000 hakkında foton / s foton oranları ile sonuçlanan lazer güç kullanın. Bir yüksek kullanırkenAfiniteli göstergesi - burada Oregon Green 488 BAPTA - 1 - Bu sinyal bireysel ani tespit etmek için yeterlidir. Şek. 3E çok düşük uyarma oranı, tespit penceresi içinde bir kayıt için bir örnek, çok yüksek bir oranda bir uyarma kaydedilen bir floresan sinyalinin bir örneğini göstermektedir.

Tek hücreli ve tek başak çözünürlük ile nöral aktiviteyi kaydetmek için diğer teknikleri ile karşılaştırıldığında, rasgele erişim tarama aynı, yerel popülasyondaki nöronlar daha çok sayıda kayıt yapabilirsiniz titrek ve tetrode / multielectrode kayıtları karşılaştırıldığında, örneğin daha az invaziv . Böylece titretilmiş rasgele erişim tarama supratreshold aktivitesi 6 (Şek. 4A), nöronlar (kortikal plastisite) bir nüfus nöral aktivitenin değişiklikler bildirilir karşılıklı bilgi ölçmek için birçok nöronların nöral aktiviteyi kaydetmek ve supratreshold aktivite yayılımı için kullanılabilir nöronların 14 popülasyonlarının (Şekil 4B) ile

figure-protocol-2 alt = "Şekil 1" src = "/ files/ftp_upload/4052/4052fig1.jpg" />
Şekil 1. Titretilmiş-rasgele erişim tarama kurulum Optik tasarımı.

figure-protocol-3
Şekil 2 Hizalama ve test:. Farklı koşullar altında kaydedilen floresans sinyallerin dağılımları. A) yüksek PMT kazancı, ancak hiçbir lazer ışığı az lazer ışığı ve düşük fotoçoğaltıcı kazanç, B) Hayır, dağıtımı nedeniyle fotoçoğaltıcı karanlık akım geniştir. C) lazer ile ve yüksek PMT kazancı kaydedildi. B gösterildiği dağılımı ve bu dağılımı arasındaki fark ikaz ışığı PMT dedektörleri ulaşır işaret eder. D) floresan sinyallerin dağıtımı nöron somata yüksek kazanç kaydedildi. Başka hiçbir gürültü kaynağı katkıda bulunuyorsa, bu dağıtım atış gürültü foton sadece doğar.

. Jpg "/>
Şekil 3 dithering ilkesinin bir döngü nöron somata pozisyonları tespit etmek ve seçmek için A) Tam kare floresan görüntüsü, B) Tarama yolu, C) İllüstrasyon;. Her soma (daire) çeşitli yerlerde sonraki ışın taşımadan önce kaydedilir iki D / A kanalların çıkış soma, D) Çizim. Her bir nöron soma için, floresan sinyalinin her soma 4 farklı lekeler (S1-S4) dan kaydedilir. Her nokta konumu x ve y pozisyonu verilir. X ve bütün noktalar ve tüm nöronlar için y pozisyonları sıralı bir şekilde dijital-analog dönüştürücü gönderilir. Kiriş, iki nöronun somata arasında taşınmış olsa da, herhangi bir sinyal (boş) elde edilir. E floresan sinyalleri) Örnekler. Her örnek (gibi elektrofizyolojik hücre ekli kayıt ile ölçülür) bir başak yanıt gösterir unutmayın.

figure-protocol-4
Şekil 4. Corti incelenmesical fonksiyonu titretilmiş rasgele erişim tarama kullanarak. A) nöron popülasyonları tarafından işaret karşılıklı bilgi Ölçme. Üst resim bir akut beyin dilim ve katman 4 (L4) aynı kortikal sütuna yerleştirilen iki stimülasyon pipetler fotomikrografıdır gösterir. Merkezi grafikler bir uyarıcı her tekrarı için sinir tepkiler göstermektedir. Alt grafik nöronların Kaydedilen nüfus tarafından işaret Shannon karşılıklı bilgi gösterir. Kortikal nöronların popülasyonlar arasındaki supratreshold spiking aktivite B) Ölçme yayılımı (sinyal yayılımı). Üst grafiği deney tasarımı göstermektedir, merkezi görüntü floresan görüntü gösterir, kesikli çizgiler varil sınırları gösteren, düşük grafik talamokortikal lifler (üçgenler) elektriksel uyarımın etkisi tespit ani gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dithered rasgele erişim tarama dolaylı bir nöron somata her başak ile ilişkili intraselüler somatik kalsiyum artar supratreshold spike aktivitesini algılar. Intraselüler kalsiyum artar floresan kalsiyum boyalar ile tespit edilir. Titretilmiş rasgele erişim tarama sınırlamaları kalsiyum floresan sinyallerin sınırlı sinyal-gürültü oranı büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Sinyal-gürültü oranı yüksek uyarma oranları kullanılarak izin vermez fotoyaşlanma, sınırlı da bulunmaktadır. Çünkü sınırlı sinyal-gürültü oranı, başak algıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz eleştirel yazının okunması için Dr Randy Chitwood ederim. Bu çalışma Whitehall Vakfı ve HJK için Alfred P. Sloan Vakfı hibe ile desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
Optik bileşenleri lazer başlayarak, sırayla listelenir
Titan: Safir Lazer Tutarlı A.Ş. Bukalemun Ultra 2 Yüksek güç çıkışı önerilen (900 nm> 2W)
Akromatik lens f = 30 mm Thor laboratuvarları AC254-030-B 650-1050 nm için Anti-refle (AR) kaplama
Akromatik lens f = 100 mm Thor laboratuvarları AC254-100-B AR 650-1050 nm
Lens f = 75 mm Thor laboratuvarları LA1608-B AR 650-1050 nm
Lens f = 175 mm Thor laboratuvarları LA1229-B AR 650-1050 nm
Akromatik lens f = 300 mm Thor laboratuvarları AC254-300-B AR 650-1050 nm
Akromatik lens f = 100 mm Thor laboratuvarları AC254-100-B AR 650-1050 nm
Akromatik lens f = 100 mm Thor laboratuvarları AC254-100-B AR 650-1050 nm
Acousto-optik deflektörleri Intraaction Corp ATD 6510CD2
Reflektif kırınım ızgarası Newport 53-011R 65 MHz bant genişliği ve 45 mrad tarama açısı ile AODs 100 oluklar / aa
21.6 mm Brewster prizmalar Lambda Araştırma Optik A.Ş. IBP21.6SF10
Renkli Cam Schott BG-39
Dichroic ayna Chroma Technology Corp Z532RDC
Photomultiplier modülleri Hamamatsu H9305-03
DAC-ADC kurulu National Instruments PCI-6115
Oregon Yeşil 488 Bapta-01:00 Invitrogen O-6807

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy. J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73(1990).
  3. Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision. J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).
  4. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat. Methods. 7, 399-405 (2010).
  5. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
  6. Pita-Almenar, J. D., Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Impact of cortical plasticity on information signaled by populations of neurons in the cerebral cortex. J. Neurophysiol. 106, 1118-1124 (2011).
  7. Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
  8. Lin, B. J., Chen, T. W., Schild, D. Cell type-specific relationships between spiking and [Ca2+]i in neurons of the Xenopus tadpole olfactory bulb. J. Physiol. 582, 163-175 (2007).
  9. Zeng, S., Lv, X., Zhan, C., Chen, W. R. Simultaneous compensation for spatial and temporal dispersion of acousto-optical deflectors for two-dimensional scanning with a single prism. Opt. Lett. 31, 1091-1093 (2006).
  10. Otsu, Y., Bormuth, V., Wong, J., Mathieu, B. Optical monitoring of neuronal activity at high frame rate with a digital random-access multiphoton (RAMP) microscope. J. Neurosci. Methods. 173, 259-270 (2008).
  11. Vogelstein, J. T., Watson, B. O., Packer, A. M., Yuste, R. Spike inference from calcium imaging using sequential Monte Carlo methods. Biophys. J. 97, 636-655 (2009).
  12. Yaksi, E., Friedrich, R. W. Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by temporally deconvolved Ca2+ imaging. Nat. Methods. 3, 377-383 (2006).
  13. Hendel, T., Mank, M., Schnell, B., Griesbeck, O. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. J. Neurosci. 28, 7399-7411 (2008).
  14. Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Correlations decrease with propagation of spiking activity in the mouse barrel cortex. Front Neural Circuits. 5, 8(2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek h cre z n rlKalsiyum g r nt lemeki fotonlu uyar mRastgele eri imli taramaDekonvol syon algoritmasSpike tespitiFloresan mikroskobu

İlgili makaleler