Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama Escherichia Coli Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Alla Gagarinova; Mohan Babu; Jack Greenblatt; Andrew Emili

doi:10.3791/4056

Method Article

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama Escherichia Coli Sentetik Genetik Diziler kullanarak

DOI:

10.3791/4056

⸱

November 12th, 2012

Alla Gagarinova*¹ , Mohan Babu*²^,³ , Jack Greenblatt¹^,² , Andrew Emili¹^,²

¹Department of Molecular Genetics, University of Toronto, ²Banting and Best Department of Medical Research, Donnelly Centre, University of Toronto, ³Department of Biochemistry, Research and Innovation Centre, University of Regina

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen denir Escherichia coli.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fenotipleri fiziksel (protein-protein gibi) ve fonksiyonel (örneğin, gen-geni ya da gen) etkileşimleri (GI) ¹ karmaşık bir dizi ile belirlenmiştir. Fiziksel etkileşim bakteriyel protein kompleksleri olarak ilişkili oldukları işaret olsa da, onlar mutlaka yolunun düzey fonksiyonel relationships1 açıklamayız. İki silinmiş veya inaktif genleri taşıyan çift mutantların büyüme ölçülür ve karşılık gelen tek mutantlar ile karşılaştırıldığında hangi GI ekranlar, lokusları arasında epistatik bağımlılıkları aydınlatmak ve dolayısıyla yeni fonksiyonel ilişkiler ² sorgulamak ve keşfetmek için bir araç sağlayabilir. Büyük ölçekli GI haritaları maya ^3-7 gibi ökaryotik organizmalar için bildirilen, ancak GI bilgi bakteriyel genomlar işlevsel açıklama engellemektedir prokaryotlar ⁸ için seyrek kalır edilmiştir. Bu amaçla, ve diğerleri, yüksek verim kantitatif bakteri GI tarama ^{yöntemleri, 9, 10} geliştirdik Burada, kantitatif E. gerçekleştirmek için gereken önemli adımları sunmak sistemik oluşturmak ve bir koloni dizisi biçiminde çift mutantlar çok sayıda spor ölçmek için doğal bakteriyel konjugasyon ve homolog rekombinasyon kullanarak coli bir genom-ölçekli ⁹ Sentetik Genetik Array (eSGA) tarama prosedürü,. Kısaca, bir robot aktarmak için kullanılır , konjugasyon yoluyla, kloramfenikol (Cm) - İşaretli F-alıcı suşlar - mühendislik Hfr gelen mutant alleli (rekombinasyon Yüksek frekans) kanamisin sıralı bir dizi (Kan) içine 'donör suşları' olarak işaretlenmiş. Genellikle, biz kayıp fonksiyon-gerekli olmayan gen delesyonlar taşıyan tek mutantlar ('Keio' koleksiyonu ¹¹ gibi) ve temel gen mutasyonları hypomorphic (azaltılmış protein ekspresyonu, istikrar, ya da etkinlik ^{9, 12, 13} görüşmekte yani allelleri) kullanın non-esansiyel ve esansiyel genler, res fonksiyonel dernekleri sorgulamakpectively. Homolog yeniden birleşme ve bunu takip eden genetik değiş tokuş aracılı sonra, elde edilen çift mutant hem de antibiyotik içeren katı ortam üzerinde seçilir. Akıbet sonra, plakaları dijital görüntülü ve koloni boyutları nicel bir in-house otomatik görüntü işleme sistemi ¹⁴ kullanılarak puanlanır. Yaktığımız bir çift mutant büyüme oranı beklenen ⁹ daha da belirgin olarak daha iyi veya daha kötü olduğu zaman ortaya çıkar. Ağırlaştırıcı (veya negatif) yaktığımız çoğu aynı temel süreç ² çarpacak telafi yollarının gelen genlerin çiftleri kaybı fonksiyon-mutasyonlar arasındaki sonuçlanabilir. Burada, tek bir gen kaybı ya da tek bir mutasyona uğramış uygun bir şekilde, arabelleğe. Ancak, her iki yollarının kaybı zararlı olduğunu ve sentetik öldürücülüğü veya hastalık (yani yavaş büyüme) ile sonuçlanır. Tersine, hafifletilmesi (veya pozitif) etkileşimleri aynı yolu ya da karmaşık protein ² genleri arasında meydana gelebilecektek başına ya da gen silinmesi sık sık yoldan veya daha fazla ilave pertürbasyonlar, böylece büyüme aktivitesini azaltır, ve olmayan bu tür karmaşık ve normal fonksiyonunu karıştırmayı için yeterlidir. Genel olarak, sistematik olarak tanımlanması ve GI ağları analiz diğer yaklaşımlar tarafından cevapsız yolağı düzeyde bilgi ⁹ varılabilir hangi genlerin, çok sayıda arasındaki fonksiyonel ilişkilerin tarafsız, global haritalar sağlayabilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Recombineering ^{15, 16} tarafından Hfr Cavalli Donör Mutant soylar oluşturma

ESGA verici lekeler oluşturmak için adımlar aşağıda tarif edilmektedir. Kısaca, biz hedef λ kullanın - Kırmızı elzem olmayan gen delesyon mutantlar (bölüm 1.1) veya daha sonra olarak kullanılan elzem geni hypomorphic mutant suşlar donör (bölüm 1.2) oluşturmak için PCR tarafından oluşturulan amplifiye seçilebilir DNA işaretleyicisi kaset homolog rekombinasyon ¹⁶ parçaladı aracılı GI ağları tanımlamak için 'sorgular'.

Not: teknoloji geliştirme sürecinde, iyi tanımlanmış ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GI'ler genler arasındaki işlevsel ilişkileri ortaya çıkarır. Benzer şekilde, aynı yoldaki genler benzer GI modelleri sergilediğinden ve GI profili benzerliği fenotiplerin uyumunu temsil ettiğinden, işlevsel olarak ilişkili genleri, GI profillerini kümeleyerek yollara gruplayabiliriz. GI ve GI korelasyon ağlarının fiziksel etkileşim bilgileri veya genomik bağlam (GC) ilişkileri gibi diğer ilişkilendirme verileriyle entegre edilmesi, bakterilerde çekirdek biyolojik sistemleri (ve sistem karışmasını) tanımlayan daha yüksek .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz GI sorgulayarak bir patika düzeyde bakteriyel gen fonksiyonlarını araştırmak için robotik eSGA tarama kullanmak için adım adım protokol ana hatlarıyla. Bu yaklaşım, E. tek tek genler hem de tüm biyolojik sistemlerde incelemek için kullanılabilir coli. Dikkatle tüm uygun kontroller dahil olmak üzere yukarıda anlatılan deneysel adımlar, yürütme ve titizlikle analiz ve bağımsız GI veri fonksiyonel yeni keşifler yapma eSGA başarısı için önemli yönleri vardır doğrulayarak. ESGA, E. GI çalışmak .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Genom Kanada, Ontario Genomik Enstitüsü ve JG ve AE AG Sağlık Araştırma hibe Kanada Enstitüsü'nün fonları tarafından desteklenmiştir Vanier Kanada Lisansüstü Bursu bir alıcı olduğunu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
I. Antibiyotikler
Chloramphenicol	Bioshop	#CLR201
		Ampisilin
		# AMP201
2. Luria-Bertani orta
>LB tozu	Bioshop	#LBL405
Agar	Bioshop	#AGR003
3. Bakteri Suşları ve Plazmitler
Hfr Cavalli suşu λ kırmızı sistemi (JL238)	Babu et al.¹⁴.
pKD3	E. coli Genetik Stok Merkezi, Yale
Keio E. coli F-alıcı koleksiyonu	Japonya Ulusal BiyoKaynak Projesi (NBRP)¹¹
Hipomorfik E. coli F- SPA-tag suşları	Açık biyosistemler; Babu et al.¹⁴
4. Primerler
pKD3 bazlı tuzdan arındırılmış sabit astarlar			F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'Tuzdan
arındırılmış özel astarlar			Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGAAGG-3' cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'Tuzdan
arındırılmış özel astarlar			F2 ve R2: pKD3 dizisine dayalı 20 nt sabit bölge ve 45 nt özel homoloji bölgesi F2 sabit bölgesi: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 sabit bölgesi: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 ve S2: SPA-Cm kasetinin amplifikasyonunu hazırlamak için 27 nt sabit bölge ve 45 nt özel homoloji bölgesi S1 sabit bölgesi: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 sabit bölgesi: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F ve KOCO-C: 20 nt primer, esansiyel olmayan gen delesyon bölgesinden veya essential gen SPA etiketi ekleme bölgesinden 200 bp uzakta
5. PCR ve Elektroforez Reaktifleri
Taq DNA polimeraz	Fermentas	# EP0281
10X PCR tamponu	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTP'ler	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl₂	Fermentas	# EP0281
Agaroz Bioshop		# AGA002
Yükleniyor boya	NEB	#B7021S
Etidyum bromür	Bioshop	# ETB444
10X TBE tampon	Bioshop	# ETB444.10
Tris Baz Bioshop		# TRS001
Borik asit	Sigma	# T1503-1KG
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# B6768-500G
DNA merdiveni	NEB	#N3232L
6. DNA izolasyonu ve Temizleme Kitleri
Genomik DNA izolasyon ve saflaştırma kiti	Promega	#A1120
Plazmid Midi kiti	Qiagen	# 12143
QIAquick PCR saflaştırma kiti	Qiagen	#28104
7. PCR, Transformasyon ve Replika sabitleme ekipmanı
Termal döngüleyici	BioRad, iCycler
Agaroz jel elektroforezi	BioRad
Elektroporatör	Bio-Rad GenePulser II
0,2 cm elektroporasyon küveti	Bio-Rad
42 & deg; C su banyosu çalkalayıcı	Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 santrifüj	Beckman Coulter
32 & C çalkalayıcı	New Brunswick Scientific, ABD
32 &d; C plakalı inkübatör	Fisher Scientific
RoToR-HDA tezgah üstü robot	Singer Instruments
96, 384 ve 1,536 pin yoğunluk pedleri	Singer Instruments
96 veya 384 uzun pimler	Singer Instruments
8. Görüntüleme Ekipmanları
Kamera standı	Kaiser
Dijital kamera, 10 megapiksel	Herhangi Bir Satıcı
Işık kutuları, Testrite 16" x 24" birimler	Testrite
9. Pedler veya Plakalar Geri Dönüşüm
%10 çamaşır suyu	Herhangi Bir Satıcı
%70 etanol	Herhangi Bir Satıcı
Steril damıtılmış su	Herhangi Bir Satıcı
Akış başlığı	Herhangi Bir Satıcı
Ultraviyole lamba	Herhangi bir Satıcı
10. Labware
>50 ml polipropilen tüpler	Herhangi Bir Satıcı
1.5 ml mikro santrifüj tüpleri	Herhangi Bir Satıcı
250 ml konik pullar	VWR	# 29140-045
15 ml steril kültür tüpleri	Thermo Scientific	# 366052
Kriyojenik şişeler	VWR	# 479-3221
Dikdörtgen Plakalar	Singer Instruments
96 kuyulu ve 384 kuyulu mikrotitre plakaları	Singer Instruments	Nunc
Sigma	#R1275		sızdırmazlığı için silindir
	ABgene	# AB-0580
Yapışkan plaka contaları	Fisher Scientific	# 13-990-14-80
& deg; C dondurucu	Herhangi Bir Satıcı

Kanamisin#KAN201 Plate çok kuyulu plakalarının

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data. PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).
Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Charting the genetic interaction....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama Escherichia Coli Sentetik Genetik Diziler kullanarak

In This Article

Summary

Abstract

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles