Method Article

C. elegans Takip ve Davranış Ölçme

DOI:

10.3791/4094

⸱

November 17th, 2012

 ,  ,  , 
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Physics and Astronomy, Vrije Universiteit, 3Okinawa Institute of Science and Technology, 4Department of Physics, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz kayıt ve sayısal bir video-hızı izleme mikroskop sistemi geliştirdik C. elegans davranışı. Biz de tamamen solucanın şeklini tanımlayan ölçümleri temel bir dizi solucan görüntülerin boyutluluğu azaltmak için hesaplamalı yöntemler geliştirmişlerdir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz C. lokomotor davranışları ölçmek için enstrümantasyon, görüntü işleme ve veri analiz teknikleri geliştirdiler elegans bir agar plaka yüzeyi üzerinde tarama gibi. Davranış, C. genetik, biyokimyasal ve nöronal temelini çalışma için Bu mikroskop mükellef, genetik uysal ve taksiler, öğrenme ve sosyal etkileşim 1,2 dahil olmak üzere karmaşık davranışlar, bir dizi gösterir çünkü elegans ideal bir organizmadır. Onlar agar plaklarına sürün solucanlar hareketleri izlemeye dayalı Davranış analizi duyusal davranışları 3, lokomosyon 4, ve genel mutasyonel fenotipleme 5 çalışmada özellikle yararlıdır olmuştur. Sistemimiz solucanlar hiçbir mekanik uyarana solucan iletilir sağlayan sabit bir agar plaka üzerinde taradığı gibi kamera ve aydınlatma sistemi hareket ettirerek çalışır. Bizim izleme sistemi kullanımı kolay ve yarı-otomatik kalibrasyon özelliği içerir. Bir chatüm video izleme sistemlerinin llenge bunu boyutlu özünde yüksek veri büyük miktarda üretir olmasıdır. Bizim görüntü işleme ve veri analiz programlarının kapsamlı sadece 3-4 boyutları 6,7 fonksiyonu olarak solucanlar davranışı yeniden bağımsız bileşenler, bir dizi içine solucan şekli azaltarak bu meydan başa. Işleminin bir örnek olarak, sonsuz dişli bir faz özel bir şekilde onun ters durumuna girer ve çıkar olduğunu göstermektedir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Takip Mikroskop Açıklaması

  1. Bir agar bir fiber ışık kaynağı tarafından aydınlatılır ve bir kamera ile görüntülenir. Bu sistem, X, Y çeviri aşama için monte edilir.
  2. Sahne bir step motor denetleyicisine bağlı olan standart step motorları tarafından taşınır.
  3. Denetleyici ve kamera bilgisayara bağlı ve LabVIEW yazılmış özel programlar tarafından kontrol edilir.
  4. Kamera görüntüleri bir agar plaka yüzey ve hafif bir arka plan üzerine koyu nesneleri tanımlar.
  5. Bilgisayar programı gerçek zamanlı olarak herhangi bir nesne ölçmek böylece görüntü kalitesi ayarlanır. Kazanç, parlaklık ve kameranın çekim hızı beyaz bir arka plan üzerinde koyu bir nesne sağlamak için ayarlanabilir.
  6. Otomatik kalibrasyon işlemi için bir kalibrasyon işareti bir solucan kıracağıyla agar yüzeyini alay tarafından yapılır.
  7. Izleme programı tarafından kullanılan filtre, ikili resmi kontrol edilebilir.
  8. Öylesineftware bir test nesne sabit bir mesafe hareket ettirerek kalibrasyon matrisi hesaplayan otomatik kalibrasyon özelliğine sahiptir.
  9. Piksel Mesafeler kalibrasyon matrisi step motor tarafından atılan adımların kalibre edilmektedir.
  10. Kalibrasyon sonra sistem gitmek için hazır olduğunu ve büyütme değiştirilmediği sürece veya kameranın yönü değiştirilmiş ise yeniden kalibre edilmesi gerekmez.

2. Takip Tabaklar ve C. hazırlanması Takip için elegans

  1. Bir bakır halka solucanlar ağıl ve plakasının kenar geçme onları tutmak için kullanılır. Bakır, yerel bir kimyasal bir engel oluşturur ve deney (<1 saat) süreleri için başka solucan hareket etkilemez. Bir ısı bloğu veya eşdeğer yerleştirerek ilk halkası ısıtın.
  2. Taze bir agar plakası üzerine il halkası (% 1.7 Bacto Agar,% 0.25 'lik Bacto-pepton,% 0.3 NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM potasyum fosfat tamponu, 5 ug / mlkolesterol) ve agar yüzeyinden içine gömmek için hafifçe bastırın.
  3. Yemek artıklarını onları yıkamak için bazı NGM tamponu (% 0.3 NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM potasyum fosfat tamponu) ile dolu bir agar plaka üzerine L4 evre veya genç erişkin solucanlar seçin. Solucanlar birkaç dakika yüzmek edelim.
  4. Dikkatle halkanın merkezine yakın izleme plaka üzerine tek bir solucan yerleştirin. Ve sonra solucanı izci üzerine plakası yerleştirin.

3. Solucan Takibi

  1. LabVIEW programı çalıştırın ve gerekirse (görüntüler için konum, resimler, ölçümler, kamera ayarları türleri) seçeneklerini belirleyin.
  2. Joystick solucanın bir görüntü kadar mikroskop hareket kullanarak görüş alanı (bilgisayar ekranında) bulunmaktadır. Izleme program yapmaya "parça" tuşuna basın.
  3. Bilgisayar programı aslında görüldüğü gibi bir ikili filtrelenen görüntüleri hareketlerini ölçer ve gerçek zamanlı olarak bu görüntü üzerinde ölçümler yapabilir
  4. Kıçtasolucanı lokal şekil değişiklikleri ayrıntılı olarak görülebilir ve küresel yörünge bir yeniden izleme er, kademeli motor hareketlerine yapılabilir.

4. Veri Analizi

  1. Solucanın şekilleri parametreleştirmek skeletonizing betik (MATLAB) çalıştırın. (Şekil 2)
  2. Iskeletize veri eigenmodes hesaplayın. (Şekil 3,4)
  3. Şekil 5 göster. Şekildeki açıklayıcı veya temsilci sonuçları okuyun.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Örnek: yem, C. elegans geçişler ileriden genellikle ileri hareket durumuna dönmeden önce bir uyarlanmasını (omega dönüş) gerçekleştirirken, hareket ters. Bu geçiş nicel hareket toplayıcılık desen anlamak ve aynı zamanda solucan motor kontrolü önemlidir. Lokomosyon davranış ince ayrıntılarını ortaya çıkarmak için güç bizim izci cihaz kullanılarak görülebilir.

Bir örnek olarak ters ve ~ 30 dakika agar plaka üzerinde serbestçe sürünerek solucanlar yüksek çözünürlüklü fotoğraf çekimi il...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lokomosyon ve doğal davranış çalışmada veri azaltma teknikleri ile ortak non-invazif izleme teknikleri gerektirir. Burada C. detaylı görüntülerini kaydeden izleme sistemi kullanımı kolay göstermiştir bir agar plaka yüzeyi üzerinde tarama gibi elegans davranış. Bu görüntülerin içerdiği bilgi miktarı büyük ve yüksek boyutlu olduğunu ve bu yüzden de sadece dört temel tedbirleri içine veri boyutluluğu azaltmak için yöntemler geliştirmişlerdir. Bu önlemler kapsamlı ve solucan davranışı açısından yorumlamak ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kısım Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
CCD kamera Basler A601f
Lens Edmund Optik MMS serisi
Fiber Aydınlatma Dolan Jenner DC-950H
Çeviri aşamasında Deltron LS3-4
Step Motor ABD dijital MS23C
Step motor sürücü Geko G201
Adım motor kontrolü SimpleStep SSXYZ
Tüm programlama kodu kullanılabilir. Yazara bir istek e-posta gönderin.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
  2. de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
  3. Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).
  4. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).
  5. Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).
  6. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028(2008).
  7. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5 (11), e13914(2010).
  8. Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115(2004).
  9. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208(2008).
  10. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  11. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
  12. Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
  13. Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).
  14. Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C elegans TrackingWorm TrackerImage ProcessingData AnalysisAgar PlateStepper MotorLabVIEW SoftwareEigen Mode AnalysisBehavioral MeasurementDimensionality Reduction

Related Articles