$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Mikroakışkan kapsülleme yöntemleri, daha önce pikolitre ölçekli sulu, monodispers damlalardaki hücreleri yakalamak için kullanılmış ve yüksek verimli tarama, sitometri ve kütle spektrometresi uygulamalarıyla toplu sıvı ortamından hapsetme sağlamıştır. Sadece tek hücreleri kapsüllemek için değil, aynı zamanda hem izolasyonu hem de kontrollü boyutlardaki gruplar halinde hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için belirli sayıda hücreyi tekrar tekrar yakalamak için bir yöntem açıklıyoruz (burada bir ve iki hücreli kapsüllemeyi gösteriyoruz). Damla oluşturma tekniklerini hücre ve parçacık sıralaması ile birleştirerek, verimli, sürekli kapsülleme için hücre boyutundaki parçacıkların kontrollü kapsüllemesini gösteriyoruz. Sulu partikül süspansiyonu ve karışmayan florokarbon yağı kullanarak, bir akış odaklama nozulu ile yağda sulu damlalar oluşturuyoruz. Sulu akış hızı, her damlada kontrollü sayıda hücreyi kapsayan, damla üretim frekansının tamsayı çoklu frekanslarında nozüle ulaşan parçacıkların sırasını oluşturmak için yeterince yüksektir. Temsili sonuçlar için, hücre vekilleri olarak 9.9 μm polistiren parçacıkları kullanılır. Bu çalışma, sırasıyla %39,3 ve %33,3'lük Poisson verimliliklerine kıyasla, tek parçacıklı kapsülleme verimliliği Pk=1'in %83,7 ve çift parçacıklı kapsülleme verimliliği P:k=2'nin %79,3 olduğunu göstermektedir. Tutarlı hücre ve partikül konsantrasyonunun etkisinin, verimli kapsülleme için büyük önem taşıdığı gösterilmiştir ve püskürtme geçişlerine damlama da ele alınmaktadır.
Giriş
Sürekli ortam sulu hücre süspansiyonları, hücrelerin paralel olarak etkileşime girmesine izin veren ve aynı zamanda ortamdan yapılan ölçümlerde belirli hücrelerin etkilerini homojenize eden ortak bir sıvı ortamını paylaşır. Hücrelerin pikoliter ölçekli damlalar halinde yüksek verimli kapsüllenmesi, damlaları çapraz kontaminasyondan korumak, numuneler içindeki hücresel çeşitliliğin ölçülmesini sağlamak, reaktiflerin ve eksprese edilen biyobelirteçlerin seyreltilmesini önlemek ve biyoreaktör ürünlerinden gelen sinyalleri yükseltmek için numuneleri sınırlar. Damlalar ayrıca, hücreler arası sinyalleşme çalışmaları için damlaları daha büyük sulu numunelere veya diğer damlalarla yeniden birleştirme yeteneği sağlar. 1,2 Seyreltmedeki azalma, daha yüksek doğrulukta ölçümler için daha güçlü algılama sinyallerinin yanı sıra potansiyel olarak maliyetli numune ve reaktif hacimlerini azaltma yeteneği anlamına gelir. 3 Hücrelerin damlalar halinde kapsüllenmesi, yüksek verimli tarama için protein ekspresyonunun,4 antikorların,5,6 enzimlerin,7 ve metabolik aktivitenin8 tespitini iyileştirmek için kullanılmıştır ve yüksek verimli sitometriyi iyileştirmek için kullanılabilir. 9 Ek çalışmalar, kütle spektrometresi10 ve hedeflenen yüzey hücresi kaplamaları için damla içeren hücrelerin biyo-elektropüskürtülmesinde uygulamalar sunmaktadır. 11 Bununla birlikte, bazı uygulamalar, damlalar halinde kapsüllenen hücre sayısını kontrol etme yeteneğinin olmaması nedeniyle sınırlandırılmıştır. Burada, bir ve iki hücre için gösterilen kapsülleme verimliliğini artıran ve daha fazla sayıda hücrenin kapsüllenmesi için tahmin edilebilen bir sıralı kapsülleme12 yöntemi sunuyoruz.
Monodispers damla üretimini elde etmek için, mikroakışkan "akış odaklama", akışların birleştiği bir nozul kullanarak bir sıvının (sulu hücre karışımı) diğeri (sürekli bir yağ fazı) içinde kontrol edilebilir boyutta damlalarının oluşturulmasını sağlar. 13 Belirli bir nozul geometrisi için, yağ ve sulu akış hızları Qyağı ve Qaq ayarlanarak damla üretim frekansı f ve damla boyutu değiştirilebilir. Akış hızları arttıkça, akışlar damla oluşumundan nozuldan sulu sıvının kararsız bir şekilde püskürtülmesine geçiş yapabilir. 14
Sulu çözelti asılı parçacıklar içerdiğinde, parçacıklar kapsüllenir ve nozülde birbirinden izole edilir. Rastgele dağıtılmış bir sulu hücre süspansiyonu kullanılarak damla üretimi için, k hücreleri içeren damlaların ortalama fraksiyonu Poisson istatistikleri tarafından belirlenir, burada Dk = λk exp(-λ)/(k!) ve λ damla başına ortalama hücre sayısıdır. "Doğru" kapsüllenmiş damlalarla sonuçlanan hücrelerin oranı Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk') kullanılarak hesaplanır. İki metrik arasındaki ince fark, Dk'nin sulu sıvının kullanımı ve kapsüllemenin ardından tamamlanması gereken damla sıralama miktarı ile ilgili olması ve Pk'nin hücre örneğinin kullanımı ile ilgili olmasıdır. Örnek olarak, damla içeren hücrelerin çoğunun yalnızca bir hücre içereceği damlaları kapsüllemek için seyreltik bir hücre süspansiyonu (düşük λ) kullanılabilir. Verimlilik metriği Pk yüksek olsa da, damlaların çoğu boş olacaktır (düşük Dk), bu nedenle boş damlaları çıkarmak için bir sıralama mekanizması gerektirir ve bu da verimi azaltır. 15
Damla oluşturmayı eylemsiz sıralama ile birleştirmek, damlaları damla başına daha öngörülebilir hücre sayısı ve rastgele kapsüllemeye göre daha yüksek verimle kapsülleme yeteneği sağlar. Ataletsel odaklanma ilk olarak Segre ve Silberberg16 tarafından keşfedilmiştir ve sonlu boyutlu parçacıkların kanal akışında yanal denge konumlarına göç etme eğilimini ifade eder. Eylemsizlik sıralaması, parçacıkların ve hücrelerin pasif olarak eşit aralıklı, kademeli, sabit hız trenleri halinde organize olma eğilimini ifade eder. Hem odaklama hem de sıralama, yeterince yüksek akış hızları (yüksek Reynolds sayısı) ve parçacık boyutları (yüksek Parçacık Reynolds sayısı) gerektirir. 17,18 Burada, Reynolds sayısı Re =uDh/ν ve parçacık Reynolds sayısı Rep =Re(a/Dh)2, burada u karakteristik bir akış hızı, Dh [=2wh/(w+h)] hidrolik çap, ν kinematik viskozite, a parçacık çapı, w kanal genişliği ve h kanal yüksekliğidir. Ampirik olarak, tam sıralı trenleri elde etmek için gereken uzunluk, Re ve Rep arttıkça azalır. Yüksek Re ve Rep gereksinimlerinin (sırasıyla 5 ve 0,5 mertebesindeki bu çalışma için), damla oluşturma nozulunda püskürmeyi önlemek için sulu akış hızlarını düşük tutma ihtiyacı ile çelişebileceğini unutmayın. Ek olarak, yüksek akış hızları, bu protokolde ele alınmayan hücreler üzerinde daha yüksek kesme gerilmelerine yol açar. Önceki sıralı kapsülleme çalışması, bu çalışmadakilere benzer akış koşulları altında tek başına kapsüllenmiş HL60 hücrelerinin %90'ından fazlasının hücre zarı bütünlüğünü koruduğunu göstermiştir. 12 Bununla birlikte, kayma gerilmelerinin büyüklük ve zaman ölçeklerinin etkisinin, farklı hücre tiplerine ve akış parametrelerine ekstrapolasyon yapılırken dikkatli bir şekilde dikkate alınması gerekecektir. Hücre sıralaması, damla üretimi ve hücre canlılığı sulu akış hızı kısıtlamalarının örtüşmesi, tek ve çoklu hücrelerin kontrollü kapsüllenmesi için ideal bir operasyonel rejim sağlar.
Parçacıklar arası tren aralığını ele alan çok az çalışma olduğundan,19,20 aralığın belirlenmesi en kolay şekilde ampirik olarak yapılır ve kanal geometrisine, akış hızına, parçacık boyutuna ve parçacık konsantrasyonuna bağlı olacaktır. Bununla birlikte, trenler arasındaki eşit yanal boşluk, hücrelerin öngörülebilir, tutarlı zaman aralıklarına ulaştığını ima eder. Damla oluşumu, sıralı hücrelerin nozüle ulaştığı oranda gerçekleştiğinde, hücreler kontrollü bir şekilde damla içinde kapsüllenir. Bu teknik, 15 kHz mertebesinde verime sahip tek hücreleri kapsüllemek için kullanılmıştır,12 60-160 Hz mertebesinde kapsülleme oranlarını bildiren önceki çalışmalara göre önemli bir gelişme.4,15 Kontrollü kapsülleme çalışmasında, damlaların %80'inden fazlası bir ve yalnızca bir hücre içeriyordu, bu da Poisson (rastgele) istatistiklerine göre önemli bir verimlilik artışı, bu da ortalama olarak %40'tan daha az verimlilik öngörüyor. 12
Önceki kontrollü kapsülleme çalışmasında,12 damla başına ortalama parçacık sayısı λ, tek hücreli kapsülleme sağlayacak şekilde ayarlandı. Akış hızlarının ayarlanması yoluyla, λ damla başına istenen hücre sayısına eşit veya yakın olduğunda, damla başına herhangi bir sayıda hücreyi verimli bir şekilde kapsülleyebileceğimizi varsayıyoruz. Tek hücreli kapsülleme, uyaranlardan bireysel hücre tepkilerini belirlemede değerli olsa da, çok hücreli kapsülleme, kontrollü sayıların ve hücre tiplerinin etkileşimi ile ilgili bilgi sağlar. Burada bir protokol, polistiren mikroküreler kullanılarak temsili sonuçlar ve pasif bir atalet düzenleme kanalı ve damla oluşturma nozulu kullanılarak birden fazla hücrenin kontrollü kapsüllenmesi için tartışma sunuyoruz.