Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yüksek Verim Micro-encapsulation Tek hücreli ve Çoklu-hücre

18K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/4096

⸱

15 Haziran 2012

 , 
1Department of Mechanical Engineering, Vanderbilt University

Bu makalede

Özet

Hücre ve parçacıkların eylemsizlik sıralamayı kümil potasyum başlatıcısı varlığında damla nesil birleştirerek, biz kHz fiyatlara tek bir damla hücre veya parçacıkların İstediğiniz bir numarayı kapsüllemek için bir yöntem tarif. Biz iki kez tek ve çift-parçacık damla sırasız encapsulation geçecek verimlilik göstermektedir.

Özet

Mikroakışkan enkapsülasyon yöntemleri, hücreleri pikolitre ölçekli sulu, monodispers damlacıklar içinde hapsetmek için önceden kullanılmış olup; yüksek kapasiteli tarama, sitometri ve kütle spektrometrisi uygulamalarında, hücreleri dökme sıvı ortamından izole ederek sınırlama sağlamaktadır. Bu çalışmada, sadece tekil hücreleri enkapsüle etmekle kalmayıp, aynı zamanda kontrol edilen boyutlardaki gruplar halinde hem izolasyonu hem de hücreler arası etkileşimleri incelemek amacıyla belirli sayıda hücreyi (burada tek ve çift hücre enkapsülasyonu gösterilmiştir) tekrar eden şekilde hapsetme yöntemini açıklıyoruz. Damlacık oluşturma tekniklerini hücre ve partikül sıralama ile birleştirerek, verimli ve sürekli enkapsülasyon için hücre boyutundaki partiküllerin kontrollü enkapsülasyonunu gösteriyoruz. Sulu bir partikül süspansiyonu ve karışmayan florokarbon yağı kullanarak, bir akış odaklama nozulu ile yağ içinde sulu damlacıklar oluşturuyoruz. Sulu akış hızı, damlacık oluşturma frekansının tam sayı katı frekanslarda nozula ulaşan partiküllerin sıralanmasını sağlayacak kadar yüksektir ve böylece her damlacıkta kontrollü sayıda hücre enkapsüle edilir. Temsili sonuçlar için, hücre sürrogatları olarak 9,9 μm polistiren partiküller kullanılmıştır. Bu çalışma, tek partikül enkapsülasyon veriminin Pk=1 %83,7 ve çift partikül enkapsülasyon veriminin Pk=2 %79,5 olduğunu; bunların sırasıyla %39,3 ve %33,3 olan ilgili Poisson verimlerine kıyasla daha yüksek olduğunu göstermektedir. Tutarlı hücre ve partikül konsantrasyonunun etkisinin verimli enkapsülasyon için büyük önem taşıdığı gösterilmiş ve damlamadan püskürmeye geçişler de ele alınmıştır.

Giriş

Sürekli ortamdaki sulu hücre süspansiyonları, hücrelerin paralel olarak etkileşime girmesine olanak tanıyan ve ortamdan alınan ölçümlerde belirli hücrelerin etkilerini homojenleştiren ortak bir sıvı ortama sahiptir. Hücrelerin piko litre ölçeğindeki damlacıklara yüksek verimli enkapsülasyonu, örnekleri sınırlandırarak damlacıkları çapraz kontaminasyondan korur, örnekler içindeki hücresel çeşitliliğin ölçülmesini sağlar, reaktiflerin ve eksprese edilen biyobelirteçlerin seyreltilmesini önler ve biyoreaktör ürünlerinden gelen sinyalleri amplifiye eder. Damlacıklar ayrıca, hücreler arası sinyalizasyon çalışmaları için damlacıkların daha büyük sulu örneklere veya diğer damlacıklarla yeniden birleştirilmesi imkanını sağlar.1,2 Seyreltmenin azalması, daha yüksek doğrulukta ölçümler için daha güçlü tespit sinyallerinin yanı sıra, potansiyel olarak maliyetli olan örnek ve reaktif hacimlerinin azaltılabilmesi anlamına gelir.3 Hücrelerin damlacıklarda enkapsülasyonu; protein ekspresyonu,4 antikorlar,5,6 enzimler7 ve metabolik aktivitenin8 yüksek verimli tarama için tespitini iyileştirmek amacıyla kullanılmıştır ve yüksek verimli sitometriyi geliştirmek için kullanılabilir.9 Ek çalışmalar, kütle spektrometrisi10 ve hedefli yüzey hücre kaplamaları11 için hücre içeren damlacıkların biyo-elektrospraying uygulamalarını sunmaktadır. Ancak bazı uygulamalar, damlacıklarda enkapsüle edilen hücre sayısını kontrol etme yeteneğinin eksikliği nedeniyle sınırlı kalmıştır. Burada, tek ve iki hücre için kanıtlanmış enkapsülasyon verimliliklerini artıran ve daha fazla sayıda hücrenin enkapsülasyonu için ekstrapole edilebilecek sıralı enkapsülasyon12 yöntemini sunuyoruz.

Monodisper damlacık üretimi sağlamak için, mikroakışkan "akış odaklama" (flow focusing), akımların birleştiği bir nozul kullanarak bir akışkanın (sulu hücre karışımı) başka bir akışkan (sürekli yağ fazı) içerisinde kontrol edilebilir boyutlarda damlacıklar şeklinde oluşturulmasına olanak tanır.13 Belirli bir nozul geometrisi için, damlacık üretim frekansı f ve damlacık boyutu, yağ ve sulu faz akış hızları Qoil ve Qaq ayarlanarak değiştirilebilir. Akış hızları arttıkça, akışlar damlacık üretiminden, sulu fazın nozuldan kararsız bir jet şeklinde çıkışına geçiş yapabilir.14

Sulu çözelti süspansiyon halindeki partiküller içerdiğinde, partiküller nozulda kapsüllenir ve birbirinden izole olur. Rastgele dağılmış bir sulu hücre süspansiyonu kullanılarak damla üretimi için, k hücre içeren damlaların ortalama fraksiyonu Dk, Poisson istatistikleri tarafından belirlenir; burada Dk = λk exp(-λ)/(k!) şeklindedir ve λ damla başına düşen ortalama hücre sayısıdır. "Doğru" şekilde kapsüllenen damlalarda son bulan hücrelerin fraksiyonu Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk') formülü kullanılarak hesaplanır. İki metrik arasındaki ince fark şudur: Dk, sulu sıvının kullanımı ve kapsülleme sonrası tamamlanması gereken damla ayıklama miktarı ile ilgiliyken, Pk hücre örneğinin kullanımı ile ilgilidir. Örnek olarak, hücre içeren çoğu damlanın sadece tek bir hücre içereceği damlaları kapsüllemek için seyreltik bir hücre süspansiyonu (düşük λ) kullanılabilir. Verimlilik metriği Pk yüksek olsa da damlaların çoğunluğu boş olacaktır (düşük Dk), bu durum boş damlaları uzaklaştırmak için bir ayıklama mekanizması gerektirerek işlem hacmini de düşürecektir.15

Damla oluşturmanın inertiyel sıralama ile birleştirilmesi, rastgele enkapsülasyona kıyasla damla başına daha öngörülebilir hücre sayılarıyla damlaların enkapsüle edilmesi ve daha yüksek verimlilik sağlama imkanı sunar. İnertiyel odaklama ilk kez Segre ve Silberberg tarafından keşfedilmiş olup16 sonlu boyutlu parçacıkların kanal akışında yan denge konumlarına göç etme eğilimini ifade eder. İnertiyel sıralama ise parçacıkların ve hücrelerin pasif olarak eşit aralıklı, şaşırtmalı ve sabit hızlı diziler halinde organize olma eğilimini ifade eder. Hem odaklama hem de sıralama, yeterince yüksek akış hızları (yüksek Reynolds sayısı) ve parçacık boyutları (yüksek Parçacık Reynolds sayısı) gerektirir.17,18 Burada, Reynolds sayısı Re =uDh/ν ve parçacık Reynolds sayısı Rep =Re(a/Dh)2 olarak tanımlanır; burada u karakteristik akış hızı, Dh [=2wh/(w+h)] hidrolik çap, ν kinematik viskozite, a parçacık çapı, w kanal genişliği ve h kanal yüksekliğidir. Ampirik olarak, tamamen sıralanmış diziler elde etmek için gereken uzunluk, Re ve Rep arttıkça azalır. Yüksek Re ve Rep gereksinimlerinin (bu çalışma için sırasıyla yaklaşık 5 ve 0,5 mertebesinde), damla oluşturma nozulunda jetlenmeyi önlemek amacıyla sulu akış hızlarının düşük tutulması gerekliliğiyle çelişebileceği unutulmamalıdır. Ek olarak, yüksek akış hızları hücreler üzerinde daha yüksek kayma gerilmelerine yol açar ve bu durum bu protokolde ele alınmamıştır. Önceki sıralı enkapsülasyon çalışması, bu çalışmadaki akış koşullarına benzer koşullar altında tekli enkapsüle edilmiş HL60 hücrelerinin %90'ından fazlasının hücre membranı bütünlüğünü koruduğunu göstermiştir.12 Bununla birlikte, farklı hücre tiplerine ve akış parametrelerine ekstrapolasyon yapılırken kayma gerilmelerinin büyüklüğü ve zaman ölçeklerinin etkisi dikkatle değerlendirilmelidir. Hücre sıralama, damla oluşturma ve hücre canlılığına ilişkin sulu akış hızı kısıtlarının örtüşmesi, tekli ve çoklu hücrelerin kontrollü enkapsülasyonu için ideal bir operasyonel rejim sağlar.

Parçacıklar arası tren aralıklarını ele alan çok az çalışma olduğu için,19,20 bu aralığın belirlenmesi en kolay şekilde ampirik olarak yapılır ve kanal geometrisine, akış hızına, parçacık boyutuna ve parçacık konsantrasyonuna bağlıdır. Bununla birlikte, trenler arasındaki eşit yan açıklık, hücrelerin öngörülebilir ve tutarlı zaman aralıklarıyla ulaştığı anlamına gelir. Damlacık oluşumu, sıralı hücrelerin nozula ulaştığı hızla aynı oranda gerçekleştiğinde, hücreler damlacık içine kontrollü bir şekilde enkapsüle edilir. Bu teknik, önceki çalışmalarda rapor edilen 60-160 Hz4,15 civarındaki enkapsülasyon hızlarına kıyasla önemli bir gelişme olan 15 kHz12 mertebesindeki verimlerle tekil hücreleri enkapsüle etmek için kullanılmıştır. Kontrollü enkapsülasyon çalışmasında, damlacıkların %80'inden fazlası yalnızca bir hücre içermiş olup, bu durum ortalama %40'tan daha az verim öngören Poisson (rastgele) istatistiklerine göre anlamlı bir verimlilik artışıdır.12

Önceki kontrollü enkapsülasyon çalışmasında,12 damla başına ortalama partikül sayısı λ, tek hücreli enkapsülasyon sağlamak üzere ayarlanmıştı. Akış hızlarının ayarlanması yoluyla, λ değeri damla başına istenen hücre sayısına eşit veya yakın olduğunda, damla başına herhangi bir sayıda hücrenin verimli bir şekilde enkapsüle edilebileceğini varsayıyoruz. Tek hücreli enkapsülasyon, uyaranlara karşı bireysel hücre yanıtlarının belirlenmesinde değerliyken; çoklu hücre enkapsülasyonu, kontrollü sayı ve türdeki hücrelerin etkileşimiyle ilgili bilgiler sağlar. Burada, pasif bir atalet sıralama kanalı ve damla üretim nozulu kullanarak çoklu hücrelerin kontrollü enkapsülasyonu için bir protokol, polistiren mikroküreler kullanılarak elde edilen temsili sonuçlar ve tartışma sunuyoruz.

Protokol

Bu bölümde protokolleri, deney sonuçları elde etmek için özel olarak kullanılan malzemeler ve ekipman açıklanmaktadır. Kimyasallar ve ekipmanlar için alternatif tedarikçiler kullanılabilir unutmayın.

1. Cihaz İmalat ve Yumuşak Litografi

Standard, yumuşak litografi teknikleri, 21 bir önceki Jove makaleler özellikli edilmiş olan bir dizi, 22 cam yüzeye bağlı polidimetilsiloksan (PDMS) mikrokanal ağlar oluşturmak için kullanılmıştır. Kenara SU-8 fotolitografi ile ana kopya kalıp imalatını, süreçlerin bir temiz oda veya temiz davlumbaz dışında yapılabilir ancak, toz ve partiküller hala tutarlı sonuçlar elde etmek için en aza indirilmelidir.

  1. AutoCAD (AutoDesk Inc) Şekil 1 'de gösterildiği gibi bir mikro-kanallı desen tasarımı. Yüksek çözünürlüklü (50.000 dpi) trans yazdırmak için üçüncü taraf üreticinin (Fineline Imaging Inc) istihdamkanal karanlık bir arka plan üzerinde şeffaf Mylar film veya kuvars parency maskesi.
  2. Çoğaltma kalıplama için silikon ve SU-8 fotorezist ana oluşturun. Kısaca, dönmeye SU-8 2050 temiz bir 7.5 cm veya 10 cm silikon üzerinde 52 mikron kalınlığında bir katman yaratmak için bir spin-lak bir üreticinin tavsiye rpm (MicroChem) negatif fotorezist. Sonra yumuşak bir fırında, kenar boncuk kaldırılması, bir kişi maske, maruziyet sonrası fırında, geliştirme, ve sel maruz kalma, bir Dektak profilometre (Veeco) kullanarak SU-8 katmanlı gerçek kalınlığı ölçümü ile UV ışınlarına maruz kalma. Teyp 4 "veya 5" Petri kabının alt üzerine master kalıp PDMS çoğaltma kalıp hazırlamak için.
  3. Sertleştirici bir 10:1 oranını w / w baz elastomer sertleştirici (Dow Corning) ile karıştırın PDMS elastomer tabanı. 2-3 mm kalınlığında son katman yaratmak için silikon ana üzerine iyi karıştırılmış PDMS habercisi dökün. 2 g sertleştirme maddesi ile 20 g elastomer baz ile bir karışımı, bir 4 "çapı yüzeyini kaplayan için yeterlidir.
  4. Maste yerleştirinde-gaz sertleşmemiş PDMS vakum desikatörde r kalıp ve PDMS (Jencons). Bir basınç regülatörü (Cole Parmer) kullanarak, yavaş yavaş aşırı köpük önlemek için 20 dakika içinde Hg "-27 için Hg" 0 odası Gage basıncı azaltmak. Hava kabarcıkları kayboluncaya kadar yaklaşık 30 dakika -27 "Hg'de vakum odasında cihazı bırakın.
  5. Vakum bırakın ve bir 65 ° dört saat en az C fırında (Thermo Scientific). Için ana kalıp ve PDMS hareket Cihaz kür iyileştirmek için bir gece boyunca fırın içinde kalabilir.
  6. Fırından çıkarın ve cihazın soğumasını bekleyin. Dikkatle PDMS dışarı hassas bir bıçak ve kabuğu kullanarak dairesel gofret etrafında PDMS kesti. Bir neşter ile Şekil 1'de gösterildiği gibi cihaz anahat kesin.
  7. Bir punch biyopsi ile Şekil 1'de gösterildiği gibi üç turda bölgelerinde Punch akışkan bağlantı noktası (cihaz başına üç). Bu cihaz için, bir 0.75 mm dış çaplı delme (Harris) kullanın.
  8. Herhangi kaldırmak için PDMS ve kabuğu desenli tarafına seloteyip uyuntoz. Geleneksel oksijen plazma cihazları için bir maliyet tasarrufu sağlayan, ancak alternatif olarak, 21,22 plazma elde tutulan bir laboratuar korona işlemcinize (Elektro-Teknik Ürünler A.Ş. kullanarak PDMS ve temiz bir 3 "x 1" cam mikroskop slayt desenli yan tedavi .). 23 Bu cihaz çeker ocak veya ozon akıntı nedeniyle iyi havalandırılan bir alanda kullanılması gerektiğini unutmayın ve tüm saatler ve cep telefonları en az on metre uzakta tutulmalıdır. Minimal kıvılcım ile istikrarlı bir korona ulaşmak için korona boşalma ayarlayın. Yavaşça yaklaşık 20 saniye boyunca her yüzey üzerinde "yaklaşık 1/4 elektrot dalgalandıracak ve sonra hemen PDMS yüzeyler doğdukları duruma dönmek önce güçlü bir bağ oluşturmak için temas yüzeyleri muamele getirebilir.
  9. Metal bir plaka üzerine cihazı yerleştirin, serin bir fırın yer, 120 ° C fırında ayarlayın ve yapıştırma tamamlamak ve bu yüksek sıcaklıkta pişirme, t sırasında orijinal hidrofobik devlet. 24 PDMS dönmek için gece boyunca fırındaO kanalın cam yüzeye de cam üzerine ince bir tabaka hidrofobik birikimi nedeniyle hidrofobik işlenecek. Alternatif olarak, bu tür Aquapel (PPG Industries) gibi hidrofobik kaplama 12 dikkatlice. Bir 1 mL şırınga ve şırınga iğne kullanılarak akışkan portu içine enjekte edilebilir, ancak sıkıca cam bağa ​​PDMS bozmadan akışkan portu içine hava püskürtme tarafından takip Aquapel enjekte . Kuruma bağlı kanallar tıkayabilir herhangi birikmeleri önlemek için herhangi bir aşırı Aquapel silmeye ise agresif, tüm giriş ve çıkış delikleri üzerinde pürjörü tekrarlayın.

2. Numune Hazırlama

  1. Seçtiğiniz hücre tipi için prosedürlere göre bir hücre kültürü hazırlayın. Bu çalışmada kullanılan özel cihaz için, 8-15 mikron partiküller veya hücrelerin yeterince encapsulation için sipariş etmeniz gerekir. Daha küçük veya daha büyük bir hücre tipleri yeterli Re p elde etmek için odaklanarak kanalının boyutları değişen gerektirebilir. Me içinThOD gösteri sonuçlar bu yazıda görüldüğü gibi, 9.9 mikron polystyrene küreler (G1000, Thermo Scientific) hücre vekilleri olarak kullanılmaktadır.
  2. Nazik karıştırma yoluyla sulu parçacık veya hücre süspansiyonu hazırlayın. Hücreleri veya polistiren partiküller kullanırken, konsantrasyon kontrolü ideal bir sipariş kapsülleme ulaşmak için (bkz. Şekil 4) esastır. Önceki verileri 12 bir kılavuz olarak kullanarak, sipariş tren aralığı ve mikro-kanal boyutuna göre istenen hücre veya partikül konsantrasyonu hesaplamak gibi: bir hücre ya da beklenen boyuna tren boşluğu kez odaklama kanal kesit alanı başına parçacık. Stok konsantrasyonları (% 1 w / w) yetersiz olduğu durumda, hafifçe bir karıştırma veya yumuşak bir vorteks ile parçacıklar, stok Örnek santrifüj süpernatan sıvıyı, ve yeniden süspanse ederek ve süspansiyonu (burada% 1.5 w / w) konsantrasyonunu arttırmak hücreleri kullanırken. İstenen toplama hacmi ve fl ile ilişkili çalışma süresi hesabı için yeterli hacmi hazırlayınow ayarlama.
  3. Hücreleri ve polistiren parçacıkların her ikisi birden büyük bir özgül ağırlığa sahiptir. Bu protokolde gösterilmiştir olmamakla birlikte, saat için pek çok dakika için kalıcı uzun süreli deneyler için, yüzdürme hücreleri için partiküller ya OptiPrep (Sigma-Aldrich) için bu tür CaCI2 olarak çözünen ekleyerek çözeltisi eşleşir.
  4. Bir 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne flüorokarbon yağı FC-40 (3M) ve doldurulmuş vaziyette sevk-PEG blok kopolimeri sürfaktan 25 (% 2.5 w / w) (Raindance Technologies) karıştırılması ile sürekli bir flüorokarbon yağ fazı bir 10 ml numunesinin hazırlanması. Alternatif olarak, ışık mineral yağ (PTI Proses Chemicals) Abil-EM 90 yüzey aktif madde (% 2.5 w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation) ile birlikte kullanılabilir.

3. Deney Düzeneği

  1. Ters optik mikroskop (Axio Observer, Zeiss) ve yüksek hızlı kamera (Phantom V310, Vision Research) açın. Veya elle cihazı hareket ettirerek takunyalar ve enkaz kanalları Odak ve teftişmotorlu bir mikroskop sahne kullanarak. Sıvı akar Bazı küçük birikimler itilmiş olabilir. Odaklanan kanalda enkaz kaliteyi önemli ölçüde sipariş düşürebilir gibi büyük enkaz veya bariz takunya için, cihaz başka bir kanalı seçin. Takunyalar genellikle künt cımbızla etkilenen bölgenin üstüne PDMS yüzeye sıkıca basarak akışı altında çıkarılabilir unutmayın.
  2. Üç sulu giriş için PVC boru uzunluğu (0.01 "ID/0.03" OD, Tygon), yağ giriş ve çıkış emülsiyon kesin. Ölü hacmi en aza indirmek için yeterli boru şırınga pompaları ile mikroskop aşamaya ulaşmak için kesti. Akışkan liman içine yerleştirilmesi kolaylaştırmak için 45 ° açıyla boru uçlarını kesin.
  3. Tüp Adım 1 yumrukladı akışkan portlarına biter sığacak basın ve ardından ilgili sulu ve yağ giriş tüpleri (Yapışkan gerekli) serbest biter içine iki adet 30 ayar künt uçlu paslanmaz çelik şırınga iğneleri (SmallParts) sığacak basın cımbız kullanın . Bir atık r içine çıkış boruları yerleştirineservoir. Bu tüp daha sonra toplama haznesi içerisine taşınacaktır.
  4. , Mikroskop sahneye cihazı ve bağlı boru taşıma hizalayın ve kullanılabilir bir nesnel (20x Bu deney için kullanılan) kullanan cihaz meme odaklanın. Optimal kayıt için gerekli K hler aydınlatma ve diğer mikroskop ayarları için ayarlayın.
  5. Adım 2 'de hazırlanan yağ fazı çözeltisi ile iyi karıştırılmış, sulu faz ve bir 3 mL şırınganın (BD) ile 1 mL şırınganın (BD) doldurur. Herhangi bir ses herhangi bir şırınga kullanılabilir ve dikkatle istenilen çalışma sürelerini ve herhangi bir pulsatilite azaltılması bağlı olarak seçilmesi gerektiğini unutmayın. Dikey bir şırınga yatırın ve enjektör çıkışına hava kabarcıkları taşımak için hafifçe vurun. Yavaş yavaş şırınga ucu için hava itmek için yeterli piston basınız. Şırınga tutarak dikey olarak, zaten Basamak 3.3 'de cihazına bağlanmış ilgili şırınga iğneye şırınga bağlanabilir. Sıvı p kadar şırınga iğnesinin ölü hacim ile hava zorlamak için piston sıkıpneredeyse cihaza borular yoluyla ushed. Güvenli bir şırınga pompası (Nexus 3000, Chemyx) için şırınga monte ve pistonu blok meşgul. İkinci şırınga bağlantıları tekrarlayın ve ikinci bir şırınga pompası için monte edin.
  6. Her bir şırınga pompası ve pompa üreticinin protokolleri kullanarak programı açın. Q yağa başlangıç ​​akış oranı ayarlamak = 50 ul / dak ve Q aq = 5 ul / sırasıyla yağ fazında ve sulu faz için dak. Pompalar başlatın.
  7. Kalan ölü havayı dışarı iterek, cihaz girin ve kanalları doldurmak için her bir akışkan için bekleyin. Bu işlem birkaç dakika sürebilir. Giriş hortumu bir hava büyük miktarda olması durumunda havanın dışarı atılır kadar, geçici bir süre için her bir akış hızını artırmaktadır. Potansiyel PDMS-to-cam bağı yetmezliğine yol, kanal büyük basınçlar meydana böylece yüksek debi artışı yok.
  8. İlk akım hızları kullanarak, ağzında damla oluşumu gözlemlemek (sonuçları burada gösterilmiştir: 20x magnification, kare hızı 21005 fps, pozlama 3 μs). Çerçeve hızı en üst düzeye çıkarmak ve mümkünse bellek gereksinimlerini azaltmak için sadece memeye kameranın görüş alanını azaltın. Örnek videoları yakalayın ve örnekleme oranı aliasing önlemek için yeterli olduğunu onaylayın.
  9. (Bkz. Şekil 2) jeti önlemek için, düşük sulu akış oranları ile başlar. Yavaşça akış hızı arttıkça, uzun sulu çözeltisi kanalda parçacıkların sipariş gözlemlemek için sulu bir akış hızını artırmaktadır.
  10. Partikül konsantrasyonu nispeten az "eksik" parçacıklar ve örnek yüzdürme perçinlenememesiydi trenleri sağlamak için çok düşük ise, fiziksel şırınga çıkışına doğru parçacıkların çökelme kademeli sağlamak için şırınga çıkışına doğru şırınga pompası eğin. Bu yöntem, video protokolü gösterilmiştir. Periyodik olarak kendi ekseni boyunca şırınga dönen da istenmeyen çöktürme azaltabilir.
  11. Yeterli sipariş kez, nesil frekansı ayarlamak için yağ akış hızı ayarlamak vedamla büyüklüğü. Ortalama düşüş hacim olarak video yakalama tarafından ölçülen damla nesil frekans bölünür sulu debi kullanılarak hesaplanabilir. Iteratif istenilen kapsülleme oranları ve damla hacmi elde etmek için akış oranları hem ayarlayın.
  12. Bir kez kararlı sipariş kapsülleme teyit, bir toplama haznesine atık hazneden çıkış boruları taşımak veya sonraki testleri için başka bir cihazın içine beslenir.
  13. Damlacıklarının istenen sayıda ve hesaplanan oluşum frekansı dayalı toplama zamanı belirler.
  14. Veya denetimi için toplanmıştır emülsiyon bir numune pipet ile damla nesil video sonuçlar kullanılarak verim ölçmek için 0, 1, 2, ..., N parçacıklar içeren damla kısmını kaydeder.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Sonuçlar hem kontrollü tek-parçacık ve kontrollü çift parçacık kapsülleme (Şekil 3) elde hangi sunulmaktadır. Keserekyarısında FC-40 yağ akış hızı, tek-parçacık kapsülleme iki tane encapsulation olur. Tersine, biz daha çabuk memeye parçacıklar sunmak için sulu akış hızını arttırmış olabilir, ama biz de sulu dere jeti riski artacaktır. Şekil 3 içinde histogram Poisson verilerine karşılaştırmaları ile birlikte, iki durumda için damla ortalama parçacık fraksiyonel numarası sunulmuştur. Sıfır parçacıkları ile zaman zaman damlalar öncelikle sipariş trenlerde "eksik" parçacıklar nedeniyle vardır, yerel yüksek partikül konsantrasyonu ve bazen iki dikey odaklanarak pozisyon birine doğru göç parçacıklar istenen sonucu daha kapsüllü parçacıklar vardır durumlarda ise. Bölüm 2'de açıklandığı üzere, eşleştirme bir yüzdürme kullanılmaz edildi not edin. Bunun yerine, şırınga pompası fiziksel çalışması sırasında parçacıklar yüksek bir konsantrasyonda yol açan, şırınganın çıkışına doğru parçacık çökeltme izin verecek şekilde hareket ettirildiğinde edildi.

düzgün partikül ve hücre konsantrasyonları için ihtiyaç gösteren deneysel bir çalıştırma Şekil 4 'de gösterilmiştir. Tam sıralama olmadan, lokalize parçacıklar düzenin gruplar ve kapsüllü olan, ancak birçok damla partikül içermeyen vardır. Histogram istenen iki tane encapsulation için azalmış kapsülleme verimliliğini gösterir.

figure-protocol-1
1. Encapsulation cihazı Şekil. girişleri, çıkış ve uzun sipariş kanal a) Genel cihazı. Cihaz yüksekliği 52 mikron ve sipariş kanal genişliği 27 mikron olduğunu. b) sulu ve yağ girişleri Hem petrol girişinin büyütülmüş görünümü için sipariş kanal genişliği sırasına boşluklar ile büyük enkaz filtreleri var. c) büyütülmüş bir görünümünü memesi 22 um ve 61 um, daha geniş bir kanala ani bir genişleme memesi kasılması, ardından sulu ve yağ kanalları için, 27 mikron arasında eşit genişlikte kanalı gösterir.Burada gösterilen cihazın boyutları mikroimalat sonra bir profilometre kullanılarak teyit edilmiştir unutmayın ve maske anma boyutlarını biraz farklı. Sipariş kanal ve meme gerçek bir görüntü olarak online olarak mevcuttur Ek Şekil 1 . AutoCAD maskesi dosyası da bu yazıya ek olarak çevrimiçi dahil edilmiştir.

figure-protocol-2
Şekil 2. Bir daha geniş bir cihaz (80 mikron genişliğinde x 22 mikron yüksek) kullanarak jeti geçiş için damlama Histeresis. a) sabit FC-40 debisi (Q yağ = 45 uL / dk), sabit damla oluşumu sulu debisi Q aq = 8 uL / dak ile 10 kHz oluşur. Sulu akış oranı yavaş yavaş 10 ve m arttıkçau; sulu sıvı akışı jeti L / dk, tetiklenir. b) akış hızı 8 ul / dk 'ya kadar devam eder jeti döndürülür. Istikrarlı bir damla oluşumu kısaca sulu akış pompası (1 saniyelik bir bekleme tipik) duraklatarak yeniden kurulabilir unutmayın.

figure-protocol-3
Şekil 3. Tek ve çift parçacık kapsülleme. Damla başına bir hücre (a) Damla oluşumu Q yağ = 60 uL / dk, Q aq = 6.1 kHz bir damla nesil oranı, ortalama damla boyutu ile 9 uL / dk) 24.4 pL ve tek hücreli yakalama verimliliği iki hücre ile D k =% 79.5 ve P k = n bir örnek boyutu için% 83.7 (λ = 0.95) d = 517 damla ve n p = 491 parçacıklar. b) Damla oluşumu damla başına 30 μ için FC-40 debisi Q yağı azaltarak sadece elde edilirL / dk. Daha büyük (39.8 pL) damla iki hücreli yakalama verimliliği ile 3.8 kHz oranında oluşur D k =% 71.5 ve P k =% 79.5 (λ = 1.80) n bir örneklem büyüklüğü için d = 383 damla ve n p = 689 parçacıklar. cd) İki histogramlar damla kapsülleme tane verimleri Poisson istatistikleri (rastgele kapsülleme) ile sipariş tek ve çift-parçacık kapsülleme D k karşılaştırın. Her iki durum için, akış yönünde parçacık boşluk tam olarak sipariş, değişen parçacıklar için yaklaşık 17-18 mikron olduğunu unutmayın. Hem de tek ve çift-parçacık kapsülleme gösteren Ek videolar online olarak mevcuttur. Ek Film 3a görmek için buraya tıklayın . Ek Film 3b görmek için buraya tıklayın .

figure-protocol-4
Şekil 4. Konsantrasyon büyük ölçüde konsantrasyonu azaldıkça a), tam sipariş oluşmaz. Kapsülleme verimliliği etkiler ve trenlerde böylece "delik" beklenen parçacıklar daha az olan bazı damla bırakarak ortaya. B) histogram azaltması (gösterir D k = çift parçacık damla vardır yaklaşık olarak çok tek-parçacık vardır = 1.57 düşer λ daha düşük bir değer nedeniyle iki parçacık encapsulation için% 55.9, p k =% 70.9). Q yağından Bu sonuçlar Şekil = 30 ul / dak ve Q aq = 9 ul / dak, Şekil 3b için aynı akım şartları. Bir temsilci tamamlayıcı Video online olarak kullanılabilir. Ek Film 4 görmek için buraya tıklayın .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Sipariş nispeten yüksek derecede rağmen, tüm parçacıkları damla veya hücre uygun sayıda içerecektir. Encapsulation verimliliği hücreleri veya bunların toplam sayısına bölünerek istenilen doluluk ile damla kapsüllenmiş olur parçacıkların sayısı olarak hesaplanabilir. Bu ham veriler elde emülsiyon bir numune otomatik bir yüksek hızlı video algoritması ya da görüntü ile elde edilebilir. Bu parçacıklar k ve k parçacıklar içerir damla D k fraksiyonu içeren bir damla kapsüllü parçacıkların P k

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

JE Bu yazıda kullanılan teknolojiye dayalı bir patent bir mucididir.

Teşekkürler

Biz bu çalışmada kullanılan doldurulmuş vaziyette sevk-PEG yüzey örnek için Raindance Teknolojileri teşekkür ederim, ve biz PDMS kanal çoğaltmalarını oluşturmak için kullanılan silikon kalıp için BioMEMS Kaynak Merkezi (Mehmet Toner, yönetmen) teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
AutoCAD AutoDesk
Şeffaflık Maskesi Fineline Imaging Inc
SU-8 rezist MicroChem 2050
Dektak Profilometre Veeco
Petri Dish BD Falcon 351058
PDMS Silikon Elastomer Kiti Dow Corning Corp Sylgard 184, Malzeme Numarası (240) 4019862
Vakum Desikatör Jencons 250-030
Vakum Pompası Alcatel Vakum Teknolojisi 2010 C2
Vakum Regülatörü Cole-Parmer EW-00.910-10
Fırın Thermo Scientific Lindberg Mavi M, OV800F
Biyopsi Punch, 0,75 mm Harris Uni-Core 15.072
Laboratuvar Corona treater Elektro-Teknik Ürünler A.Ş. BD-20AC, SKU 12051A
Cam Slaytlar Altın Mühür 3010
Aquapel PPG Industries Alternatif Strateji
Polistiren Mikroküreler, 9.9 mikron Thermo G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 Kanıtlanmış değil
Luer-Lok Şırınga BD 1 mL: 309.628
3 ml: 309.585
FC-40 Florokarbon Yağ 3M A.Ş. Sigma Aldrich, F9755
Doldurulmuş vaziyette sevk-PEG Fluorosurfactant Raindance Teknolojileri
Işık Madeni Yağ PTI Proses Kimyasalları 08042-47-5 Alternatif Strateji
Madeni Yağ Yüzey Evonik Goldschmidt Şirketi Abil EM 90 Alternatif Strateji
Tygon PVC Boru SmallParts TGY-010
30 Gauge Luer-Lok Şırınga İğne, 1/2 " SmallParts ND-301PL-C
Ters Mikroskop Carl Zeiss Görüntüleme Axio Observer.Z1
Yüksek Hızlı Kamera Vizyon Araştırma Phantom V310
Şırınga Pompaları (2) Chemyx A.Ş. Nexus 3000
Silikon Yağı Dow Corning 200 sıvısı, 10 cSt Emülsiyon Depolama için opsiyonel

Kaynaklar

  1. Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
  2. Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
  3. Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
  4. Huebner, A. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications. , 1218-1220 (2007).
  5. Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
  6. Bradshaw, E. M. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
  7. Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
  8. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Koster, S. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
  10. Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
  11. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001(2010).
  12. Edd, J. F. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
  13. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364(2003).
  14. Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99, (2007).
  15. Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
  16. Segrí, G., Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
  17. Carlo, D. D. i Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
  18. Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102, (2009).
  19. Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703(2010).
  20. Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413(2010).
  21. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane. Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
  22. Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319(2007).
  23. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  24. Hatch, A. C. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. , 3838-3845 (2011).
  25. Holtze, C. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
  26. Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94, (2005).
  27. Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
  28. Nie, Z. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. , (2008).
  29. Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
  30. Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
  31. Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
  32. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mikroakışkan KapsüllemeAkış Odaklamalı NozulAtaletsel SıralamaTek Hücre KapsüllemeÇift Hücre KapsüllemePartikül VekilleriDamla Üretim HızıSulu Faz Akış HızıYağ Faz Akış HızıKontrollü Kapsülleme
Yüksek Verim Micro-encapsulation Tek hücreli ve Çoklu-hücre
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.